烟曲霉次级代谢产物抗菌与抗肿瘤活性研究

王 胤

(西南大学药学院，重庆 400716)

烟曲霉(Aspergillusfumigatus)系子囊菌纲(Ascomycetes)曲霉属的真菌，在自然界中分布广泛。其分生孢子漂浮在空气中，通过呼吸道进入人体，主要引起肺部感染，进而引起侵袭性曲霉病[1]。研究表明其代谢产物具备一定开发为活性药物的潜力，迄今为止已从烟曲霉代谢产物中分离出多个化合物，但由于毒性较大或药理活性一般、产物量甚微等原因，开发难度很大[2]。近年来发现其中一些化合物具有新的药理活性[3～6]，尤其在抗肿瘤等方面有着较为积极的意义，既可用来研究肿瘤的发生、发展、侵袭与转移的机制，又可通过结构改造以降低副作用获得全新的抗肿瘤药物。

作者在此对烟曲霉次级代谢产物进行了初步活性研究，拟为进一步确定其活性单体成分奠定基础。

1 实验

1.1 试剂与仪器

小牛血清(FCS)，杭州四季清公司；RPMI-1640细胞培养基，Hyclone公司；DMSO，Sigma公司；MTT[四氮唑盐，3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]。

My Cycler Thermal Cycler型PCR仪、Model 680型酶标仪，美国BIO RAD；DYY-8C型双向电泳仪，北京六一；KYC-1102型摇床，上海福玛；微量高速离心机，长沙湘仪。

1.2 菌株与培养基

菌株从三峡库区土壤中分离得到，命名为IMBSX-28，经鉴定为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。

发酵培养基(马铃薯-葡萄糖液体培养基，PD培养基)：取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 L煮沸30 min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1 L，加葡萄糖20 g，灭菌30 min。

营养肉汤培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加水至1 L，溶解灭菌30 min。

改良马丁培养基：胰蛋白胨5 g，酵母浸出物2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂20 g，加水至1 L，溶解灭菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离纯化与鉴定

采用平板法和稀释划线法在PDA平板上对菌株进行分离纯化。通过形态学分析、对提取菌体rDNA进行PCR扩增再进行ITS序列分析[7]，鉴定该菌为Aspergillusfumigatus。

1.3.2 菌株发酵

将纯化后的菌株涂到PDA平板上生长7 d，挑取适量菌体至装有50 mL已灭菌 PD培养基的250 mL摇瓶中，在28℃、220 r· min-1条件下发酵培养7 d。共发酵140瓶。

1.3.3 发酵产物的提取

将发酵7 d的菌体与发酵液离心过滤。将发酵液浓缩2/3，加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液浓缩至干，得烟曲霉胞外次级代谢产物乙酸乙酯部分。菌体加入甲醇进行破碎并萃取3次，每次24 h，合并萃取液，得烟曲霉胞内次级代谢产物，减压浓缩至不含甲醇，再加入乙酸乙酯提取，得到菌体提取物浸膏。

1.3.4 抗菌活性分析

用甲醇将发酵液与菌体乙酸乙酯提取部分浓度调至1 mg · mL-1。抗菌活性采用琼脂—纸片扩散(KB)法测定。指示菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和白色念珠球菌(Candidaalbicans)。指示细菌和指示真菌分别用营养肉汤培养基和改良马丁培养基进行培养。用100 μg · mL-1卡那霉素和50 μg · mL-1制菌霉素作为抗菌实验的阳性对照。通过观察烟曲霉次级代谢产物对指示细菌和指示真菌生长的抑制来分析抗菌活性。

1.3.5 抗肿瘤活性分析

人肺癌A549细胞用 RPMI-1640培养基 (含 10%小牛血清)常规继代，在通有5%(体积分数) CO2的细胞培养箱内，于37℃培养。采用MTT法测试烟曲霉胞内次级代谢产物对A549细胞增殖的抑制作用，同时通过显微镜下细胞形态学检测，初步判断有无细胞凋亡诱导、坏死性细胞毒等活性。

MTT法检测抗肿瘤活性的具体步骤为：将处于对数生长期的A549细胞消化接种于96孔细胞板，细胞浓度为0.5×105个· mL-1，每孔200 μL，细胞接种48 h后加入20 μL不同浓度的烟曲霉次级代谢产物粗提液，使终浓度(μg · mL-1)分别为：400、200、100、50、25、12.5。每个浓度设5个复孔，以同样体积甲醇(代谢产物溶剂)作为阴性对照。继续培养48 h。然后每孔加入10 μL 5 mg · mL-1MTT，37℃作用4 h，再加入100 μL DMSO，室温下振荡10 min，用酶标仪在490 nm 波长下测定吸光度OD值。根据OD值计算抑制率和半数抑制浓度IC50。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离与鉴定

烟曲霉菌体为墨绿色，在 PDA平板上培养2 d长出白色较长菌丝，第3 d后变成绿色并产孢。通过ITS序列分析，用ITS1和ITS4作为PCR引物进行扩增，并测序。通过美国 NCBI网站在线的 Genbank获取与测得的序列相似的多个序列，相似度最接近的为99%。鉴定该菌为Aspergillusfumigatus。

2.2 抗菌活性(表1)

表1 烟曲霉IMBSX-28提取物抗菌活性分析

由表1可知，同等条件下烟曲霉发酵液与菌体的乙酸乙酯提取部分都具有一定的抗菌活性，但均限于对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)活性较强，对其它菌(革兰氏阴性菌和真菌)则无活性。

2.3 抗肿瘤活性

以烟曲霉IMBSX-28提取物处理人肺癌A549细胞24 h，测定其对细胞增殖的抑制活性。结果发现，烟曲霉菌体的乙酸乙酯提取部分在 200 μg · mL-1左右时能够显著抑制人肺癌 A549细胞的增殖，对癌细胞有很强的抑制作用，抑制率为100%，IC50为(228±0.52)μg · mL-1。而胞外发酵液的乙酸乙酯提取部分基本没有抗人肺癌A549细胞的作用。

菌体提取物对A549细胞作用24 h后的细胞形态见图1。

图1 菌体提取物作用24 h后A549的细胞形态

2.4 讨论

对于烟曲霉次级代谢产物的研究已有一些文献报道，并且分离得到了不同的化合物。研究主要针对以下几个方面：(1)不同来源烟曲霉的代谢产物不同。已有对从海洋分离出的烟曲霉进行次级代谢产物研究的报道。(2)不同发酵条件获得的代谢产物也不同。这方面文献报道较少。(3)更好的分离纯化技术的应用，对以前获得的很少量的物质也可以进行纯化和结构分析。本实验发现，对于烟曲霉来说，更多的活性成分存在于胞内，通过对其胞内代谢产物的研究应该可以找到相应的活性单体化合物。因此，后续研究将对活性较明显的胞内组分，通过萃取、柱层析、制备高效液相色谱等分离纯化手段进行分离与纯化，得到不同的单体组分；然后再通过质谱、核磁、红外等不同手段，进行结构解析，了解相应活性物质的详细结构。

3 结论

通过对烟曲霉次级代谢产物活性的初步研究，发现烟曲霉的次级代谢产物成分比较复杂，其中很多具有药理活性，特别是有一定的抗菌和抗肿瘤活性，且活性成分主要存在于胞内。因此，烟曲霉次级代谢产物的研究对抗肿瘤药物的开发具有一定意义。

[1] Latge J P.Aspergillusfumigatusand Aspergillosis[J].Clinical Microbiology Reviews，1999，12(2)：310-350.

[2] 朱平，刘巨波.烟曲霉产物的药理活性与抗癌新药研究前景[J].中国药学杂志，1998，33(11)：645-648.

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[4] Hamayun M，Sumera A K，Mir A K，et al.Gibberellin production by pure cultures of a new strain ofAspergillusfumigates[J].World J Microbiol Biotechnol，2009，25(10)：1785-1792.

[5] 韩小贤，许晓妍，崔承彬，等.海洋真菌烟曲霉H1-04发酵液中的硫代二酮哌嗪类产物及其抗肿瘤活性[J].中国药物化学杂志，2007，117(13)：155.

[6] 赵文英，朱庆书，顾谦群.海洋来源真菌烟曲霉(Aspergillusfumigatus)次级代谢产物研究(Ⅱ)[J].青岛科技大学学报(自然科学版)，2007，28(5)：390-393.

[7] 张志华，洪葵.核酸序列直接分析在真菌鉴定方面的应用[J].华南热带农业大学学报，2006，12(2)：39-43.