霉酚酸对人骨髓来源间充质干细胞的作用

曹伟杰，刘丽珍，来晓瑜，王冲，于晓虹，黄 河

(1.浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，浙江杭州310003;2.郑州大学第一附属医院血液科，河南郑州450052)

霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)是霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)在体内代谢后的活性成分，它是一种强效非竞争性次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂。MPA通过抑制IMPDH，耗竭T细胞和B细胞内的鸟嘌呤核苷酸和脱氧鸟嘌呤核苷酸，抑制这两种细胞的增殖以及抑制B细胞生成免疫球蛋白［1］。目前MMF作为免疫抑制剂广泛应用于实体器官移植和异基因造血干细胞移植，而且在治疗自身免疫性疾病方面也显示了良好的应用前景。近年来研究表明，MPA不仅仅作用于免疫细胞，对多种非免疫细胞也有一定的作用，如能明显抑制成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和肾小球膜细胞的增殖［2-4］。最新研究表明，MMF对多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤等血液恶性肿瘤有抑制增殖和促进凋亡的作用［5-6］。为此，我们推测MPA可能会对间充质干细胞产生相应影响，目前尚无MPA对人骨髓来源的间充质细胞作用研究的报道。人骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一种重要的成体干细胞，在异基因造血干细胞移植中起着重要作用，研究MPA对MSCs的作用及机制，将为临床合理应用MPA和MSCs提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 骨髓MSCs的分离培养及鉴定 骨髓细胞取材于骨髓捐献志愿者，经志愿者同意用于实验研究。在无菌条件下采集供者骨髓10 ml，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。以5×105个细胞/cm2密度接种于10%FBS LGDMEM培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱孵育。24～48 h后更换培养液，弃去非贴壁细胞，原代培养细胞贴壁汇合达80% ～90%时用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，进行传代培养并标记。取第3代 ～第6代细胞与 CD29-PE、CD166-PE、CD34-PE、CD14-FITC、CD44-FITC 和HLA-DR-FITC单克隆抗体(Beckman Coulter)孵育15 min，流式细胞仪分析检测其阳性率。

1.2 CCK-8方法检测细胞增殖 取第3代～第6代MSCs，以3×103个细胞/孔接种于96孔培养板，加入不同浓度MPA(Roche)，每孔总体系 0.2 ml，分别处理 2 d、4 d、7 d，加 CCK-8(Dojindo)工作液20 μl/孔，置培养箱中孵育4 h。以630 nm波长做为参比波长，在酶标仪450 nm波长处读取吸光度值(A)。实验重复3次，每次设复孔5个，取平均值为最终结果。计算细胞增殖率(P%)=实验组OD值/阴性对照祖OD值×100%。

1.3 流式细胞仪检测MSCs凋亡 MSCs以5×105/ml接种6孔培养板，分别加入不同终浓度霉酚酸，2 d和7 d后收获细胞。收集1×106个细胞，参照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测，Cellquest 1.2分析软件分析结果。

1.4 RT-PCR检测间充质干细胞IMPDH亚型的表达

1.4.1 RNA抽提和逆转录 用Trizol一步法提取总RNA，经紫外分光光度计测定 A260/A280值定量。用逆转录PCR试剂盒(Takara)进行逆转录反应。反应体系为10 μl，含有总RNA 2 μg，PrimeScriptTM RT Enzyme MixⅠ，Oligo dT Primer 2.5 μmol/L，Random 6 mers 5 μmol/L，反应按说明书进行。所得cDNA产物用于普通PCR反应或real-time PCR。

1.4.2 PCR反应扩增目的基因 反应总体系为 25 μl，包括逆转录产物 1 μl，MgCl21.5 mmol/L，1 ×PCR 缓冲液，dNTP 0.5 mmol/L，目的基因或内参照基因上、下游引物各0.25 μmol/L，Taq DNA合成酶1.0 U。PCR产物直接用于电泳，凝胶成像系统记录。IMPDHⅠ的PCR 引物:上游 5＇-CAAGATCCTGGACCGTGT CA-3＇，下游 5＇-TGGCACTTTCTGTGGACATCA-3＇;产物 191 bp，反应参数:94℃ 35 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共 38 个循环，72℃ 延伸 10 min。IMPDH 的 PCR引物:上游5＇-CAAGACATCTG GACCGTGTCA-3＇，下 游 5＇-CGCACTTTCTGTG GACATGCA-3＇;产物 180 bp，反应参数:93 ℃35 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共36 个循环，72℃延伸10 min。内参照基因GAPDH的PCR引物:上游 5-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3，下游 5＇-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3，产物 219 bp，扩增25个循环。

1.5 MSCs体外诱导定向分化

1.5.1 MSCs体外诱导成骨分化 第3代～第6代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，生长近70%后，更换培养液，加入成骨培养基(10%FBS的LG-DMEM含10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、0.25 mmol/L 抗坏血酸)，每隔3 d更换培养液，培养14 d，倒置显微镜观察细胞形态。诱导分化第1天加终浓度为 1、10、50 和100 μmol/L 的霉酚酸，观察对成骨分化的影响。

1.5.2 von Kossa染色鉴定细胞外钙盐沉积吸干培养液，用4%多聚甲醛固定5 min，双蒸水漂洗2次，自然晾干后，每孔加入2 ml新配制的2%硝酸银溶液，去离子水充分洗涤，置于强光或紫外线下15～30 min，双蒸水冲洗2次，镜下染色观察。

1.5.3 成骨分化钙定量 以1×105/孔接种MSCs于6孔板，成骨诱导分化第14天，吸干培养液，每孔加0.5 mol/L HCl溶解钙盐，细胞刮刀刮去细胞，将细胞4℃振荡4 h，1 000 g离心5 min，取上清用钙定量试剂盒定量检测钙盐，剩余细胞沉淀用BCA法定量检测总蛋白，用钙盐定量的值除以总蛋白(单位为μg/mg)。

1.6 real-time PCR检测目的基因 反应在96孔 PCR板中进行，反应体系 20 μl，含 Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μl(Applied Biosystems)，引物 5 μl(上下游引物各 250 nmol/L)，cDNA 模板 5 μl。封口、离心后放入7 500 real-time PCR仪(Applied Biosystems)。反应参数为95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环。完成反应后通过熔解曲线检测产物特异性。所得结果用系统自带软件进行计算。用于real-time PCR的引物序列为:BMP-2上游 5＇-TAGACCTGTATCGCAGGCACTC-3＇，下游 5＇-TTCCCACTCGTTTCTGGTAGTTC-3＇;OP 上游 5＇-CTCAGGCCAGTTGCAGCC-3＇;下游 5＇-CA AAAGCAAATCACTGCAATTCTC-3＇;Runx2 上游5＇-CAGACCAGCAGCACTCCATA-3＇，下游 5＇-CA GCGTCAACACCATCATTC-3＇;OSX 上游 5＇-GCC AGAAGCTGTGAAACCTC-3＇，下 游 5＇-GCTGCA AGCTCTCCATAACC-3＇;ATF4 上游 5＇-CAGCCG CTTCACCTACAGC-3＇，下 游 5＇-CAGCCGCTTC ACCTACAGC-3＇。

1.7 Western-blot分析蛋白质表达 细胞蛋白质提取:收集5×105个细胞，离心、弃上清，用预冷PBS洗涤2次，加SDS细胞裂解液100 μl，反复吹打，置冰上，用超声波细胞粉碎机处理(160 w，持续3 s，间隔5 s，共 3 次)，4℃ 14 000 g/min离心10 min，取上清液，BCA法测蛋白质浓度后，100℃煮样5 min，-70℃冻存备用。

取100 μg的总蛋白样本，经 10%SDSPAGE电泳分离后，转膜印迹于 PVDF膜，含5%脱脂牛奶的TBST液体中封闭1 h，洗膜;而后加入一抗(Runx2和 Osterix多抗，Cell Signaling)，4℃过夜，洗膜，加入二抗溶液中，室温温育1 h，洗膜后加增强化学发光反应底物，曝光30 s～5 min，显影、定影。

1.8 统计分析方法 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，实验结果以均数±标准差(±s)表示;两样本均数的比较采用独立样本t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用 q检验，统计学显著性检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 人骨髓来源的间充质干细胞免疫表型鉴定 第3代～第6代MSCs表达CD29、CD166、CD44，不表达 CD34、CD14 和 HLA-DR，免疫表型符合MSCs(图1)。

图1 人骨髓来源的间充质干细胞免疫表型鉴定Fig.1 The immunophenotype of human bone marrow-derived MSCs

2.2 MPA抑制骨髓来源MSCs的增殖 不同浓度MPA(1～100 μmol/L)与MSCs作用2 d～7 d，总体各浓度组的细胞增殖率均有显著差异，F值分别为80.188、63.745和71.559，P 值均小于0.01。随着时间的延长和药物浓度的增加，其增殖率从(76.53±6.01)%降低到(15.4±6.87)% 。与正常对照组相比，其差异均有统计学意义(P＜0.05，图2)。在上述各MPA浓度组中添加鸟嘌呤核苷(100 μmol/L)，MSCs的增殖率得到恢复，与相应MPA浓度组相比，差别有统计学意义(P＜0.05，图3)。

2.3 MPA对骨髓来源的MSCs无促进凋亡的作用 图4 显示 10 μmol/L、100 μmol/L 的MPA分别作用于MSCs 2 d和7 d，凋亡细胞百分数(Annexin V阳性，即LR+UR象限)分别为(8.23±1.55)%、(7.67±0.70)%和(8.20±0.51)%、(10.03±2.99)%，与空白对照组(8.20±0.74)%和(7.43±1.38)%相仿(P＞0.05)，说明MPA不能促进MSCs发生凋亡。

2.4 间充质干细胞IMPDH亚型的检测 采用RT-PCR方法检测间充质干细胞IMPDH亚型的表达，结果显示MSCs表达IMPDH1、IMPDH2(图5)。

2.5 霉酚酸对MSCs成骨分化的影响 von Kossa染色显示，从10 μmol/L浓度开始 MSCs的成骨分化明显减少，在100 μmol/L浓度下成骨分化基本消失(图6)。Ca定量方法显示MPA对MSCs成骨分化有剂量依赖性抑制作用(图7)。Osteopontin(OP)和BMP-2是成骨细胞2个重要的标志性基因，real-time PCR结果显示二者的表达也呈剂量依赖性降低(图8)。

为研究MPA抑制MSCs成骨分化的机制，本研究在各实验组中添加Guo，结果显示抑制成骨分化的作用消失(图7)。real-time PCR分析显示，在MSCs成骨分化的第7天和第14天Runx2和OSX在MPA作用下表达均明显降低，但ATF4表达无明显改变(表1);Westernblot结果也证实Runx2和OSX表达降低，加入Guo后表达得到恢复(图9)。

图5 RT-PCR检测间充质干细胞IMPDH亚型的表达Fig.5 Expression of IMPDH subtype on MSCs identified by RT-PCR

3 讨论

MPA是MMF在体内代谢后的活性成分，所以本研究直接选择MPA来研究其对MSCs的作用，临床资料显示MPA的血药浓度范围约为0.5～60 μmol/L，我们根据其血药浓度选择体外药物实验的浓度范围，以研究其作用机制［7-8］。

MPA在细胞内的作用靶点是IMPDH酶，IMPDH酶是鸟嘌呤从头合成途径的限速酶，抑制该酶的活性可使鸟嘌呤核苷酸和脱氧鸟嘌呤核苷酸耗竭，进而阻断DNA和RNA的合成。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)则是鸟嘌呤补救合成途径的限速酶，它催化鸟苷形成鸟嘌呤核苷酸。该酶有两种亚型，Ⅰ型酶表达于所有细胞，而Ⅱ型酶表达于部分细胞，与细胞的增殖和恶性转化有关，IMPDHⅡ型对MPA的敏感性比Ⅰ型高5倍以上［9］。RT-PCR结果显示MSCs表达IMPDHⅠ型和Ⅱ型酶，这一结果也解释了MSCs之所以对MPA作用敏感的原因。

本实验结果显示，MPA在1～100 μmol/L浓度范围内，能使MSCs的增殖抑制呈剂量依赖性和时间依赖性。为进一步探索MPA抑制MSCs增殖的机制，本研究首先采用流式细胞术检测了MPA对MSCs凋亡的影响，结果显示MPA各浓度组在作用的2 d和7d，均未促进MSCs的凋亡，这提示MPA不是通过凋亡途径来抑制MSCs的增殖;添加鸟嘌呤核苷后MPA的抑制效应逆转，这表明 MPA是通过抑制IMPDH酶活性而发挥抑制效应的。

图6 MPA对MSCs成骨分化von Kossa染色的影响Fig.6 The effect of MPA on von Kossa stain of MSCs afer osteogenetic differentiation

表1 MPA(100 μmol/L)对 Runx2、OSX 和ATF4表达的影响Table 1 EffectofMPA (100 μmol/L)on mRNA levels of Runx2，OSX and ATF4

图9 MPA对Runx2和OSX蛋白表达的影响Fig.9 Effect of MPA on protein levels of Runx2 and OSX

MSCs是体内一类重要的成体干细胞，可以定向分化为成骨细胞，在间质组织更新和修复中起着重要作用;而Runx2、Osterix和ATF4这3个转录因子在MSCs分化为成骨细胞以及成骨细胞特有基因的转录中具有重要作用［10］。本研究在探讨MPA对MSCs成骨分化影响的实验中，von Kossa染色和钙定量结果均表明MPA抑制MSCs的成骨分化，添加鸟嘌呤核苷后可以解除对MSCs成骨分化的抑制;采用real-time PCR方法对成骨分化途径中重要的转录因子Runx2、Osterix和ATF4进行检测，结果显示Runx2和Osterix在分化过程中7 d和14 d 2个时间点表达均降低，而ATF4表达没有改变，Western blot的结果也表明，Runx2和Osterix表达降低，加入鸟嘌呤核苷后二者表达得到恢复。这表明MPA通过耗竭鸟嘌呤核苷酸而影响Runx2和Osterix mRNA的表达，抑制Runx2和Osterix蛋白的合成，从而影响MSCs的成骨分化。

本研究发现，在血药浓度范围内MPA对骨髓来源的间充质干细胞增殖和成骨分化有剂量依赖性抑制作用，这一作用可能会影响MSCs发挥正常的生理功能及治疗作用。因此，在保证MPA足够治疗作用的同时，减少MPA的应用剂量可能会减少MPA的不良反应，我们移植中心独创性低剂量MMF的GVHD预防方案为解决这一问题提供了思路和宝贵的临床经验［11-12］。间充质干细胞不仅是重要的成体干细胞，由于其强大的免疫调节特性己被应用于临床治疗，与造血干细胞共移植以及用于治疗移植后激素耐药重度急性GVHD都显示了良好的应用前景，MSCs在临床应用中与免疫抑制剂的相互作用将是移植领域研究的一个新的方向。

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