前体MRNA可变剪接调节因子NSSR1在大肠癌中的表达

张 薇，沈 权，沈嘉希

(浙江大学城市学院医学与生命科学学院，浙江杭州310015)

NSSR1(neural salient SR protein 1)是一种新近发现的 SR(serine/arginine-rich)蛋白［1］，具有经典的SR蛋白结构特点，即N端有1个RBD(RNA binding domain)结构域，C端有3个包含Ser-Arg重复序列的RS结构域。RBD结构域可以识别mRNA序列，而RS结构域可以进行蛋白-蛋白作用［2］。研究证明，在哺乳动物中SR蛋白除了可以参与正常的前体mRNA剪接过程，还在相关的疾病中与前体mRNA的异常剪接有关，如在 SMA(spinalmuscular atrophy)中，Tra2β1(transformer 2β1)可以促进SMN2全长型蛋白的表达［3］，而在乳腺癌中Tra2β1可以促进CD44的v4以及v5外显子的掺入，这提示其可能在乳腺癌的发生及转移中发挥作用［4］。我们最近的研究［5］发现，NSSR1在子宫内膜癌中存在高表达。然而，有关SR蛋白在大肠癌细胞中的表达以及其对前体mRNA可变剪接调控的研究目前在国际上报道极少，其中Filippov等［6］发现，在培养的大肠癌细胞中存在 SRp55的表达;Goncalves等［7］发现，ASF/SF2以及 SRp20在调控Rac1b基因的3号外显子中发挥作用;Thorsen等［8］发现，SRSF1在调控SLC39A14基因的4a/4b外显子中发挥作用。

本研究通过RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学染色等方法观测NSSR1在小鼠大肠和人大肠癌组织中的表达，为探讨NSSR1在大肠癌发生发展中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 RT-PCR 成年昆明种小鼠购自复旦大学上海医学院动物房，经戊巴比妥钠麻醉后断颈处死，迅速摘取各组织器官，小鼠的大脑组织经从枕骨大孔处剪开并分离获得。RT-PCR分析:组织样品在冰上经研磨后，加入Trizol试剂并按说明书要求抽提各组织样品总RNA，然后，以Oligo-dT18为引物，用M-MLV逆转录酶按说明书要求进行逆转录反应，将所得到的cDNA作为模板进行PCR分析。NSSR1引物序列:正向 (5＇-GGAATGTCCCGCTACCTGCGT)，反向(5＇-CTTGTGGCCACTGGACTTAGG-3＇);反应条件:(94℃，5 min)–(94℃，30 s;55℃，30 s;72℃，40 s;25 ～30 个循环)–(72℃，5 min)。PCR产物用1%琼脂糖胶电泳分离，凝胶成像系统拍照(上海复日公司)，然后用Totallab软件进行条带亮度分析并统计结果。

1.2 Western blot 首先在组织样品中加入适量的裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1%NP-40，10%PMSF)，在冰浴上匀浆，放置20 min以裂解细胞，离心(13 000 r/min，15 min)，取上清，经考马斯亮蓝染色法定量后，加入等体积2×上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8;200 mmol/L DTT，4 g/L SDS，2 g/L 溴酚蓝，20%甘油)，混匀，100℃ 水浴煮沸 15 min，冰上冷却后，经10%SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)电泳分离蛋白，并转移到硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉/TBS室温封闭1 h，以兔抗人 NSSR1抗体(1∶500稀释，由本实验室自制［9］)为一抗，4℃结合过夜，TBS洗3次后，加入碱性磷酸酶(AP)标记的羊 抗兔 IgG(Sigma，St Louis，Missouri，USA)为二抗，室温结合 1h，TBS 洗 3次后以BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium，上海鼎国)为底物显色。

1.3 免疫组织化学SABC法染色 大肠癌标本来自复旦大学附属中山医院2003年5月-2006年7月手术切除并经病理证实的大肠癌患者，其中男性8例，女性5例，年龄25～69岁(平均38岁)。取瘤旁正常组织作为对照。所有临床标本均常规石蜡包埋，作连续切片，厚度为3 μm。所有切片均作免疫组织化学SABC法染色，兔抗人NSSR1抗体同上，其余试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，包括SABC试剂盒、DAB显色剂等。载玻片防脱片剂处理:选用 APES，捞片后置烤箱(58℃ ～60℃)60 min以使切片紧密黏附，切片脱蜡至水。蒸馏水新鲜配置3%H2O2，室温10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。微波修复抗原:将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 6.0，电炉加热到沸腾后断电，间隔5～10 min，反复2～3次。冷却后进行下一步。滴加正常血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗。滴加适当稀释的一抗，温箱37℃孵育60 min，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，温箱37℃孵育20 min。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，37℃孵育20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色:使用DAB显色试剂盒，将试剂盒中A、B、C试剂各l滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-30 min之间。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。

2 实验结果

2.1 NSSR1在小鼠各组织中的表达 在正常小鼠的大脑、小脑、心脏、肝脏、大肠以及肺等组织中，均存在NSSR1的mRNA表达，且各组织中的表达均比较接近包括大肠(图1A)。而NSSR1蛋白只在小鼠大脑和小脑中有表达，其余各组织包括大肠均无表达(图1B)，该结果说明NSSR1的表达具有组织特异性，在正常的肠道组织中，只存在 NSSR1的 mRNA表达，NSSR1蛋白的表达很少或不表达。

2.2 NSSR1在人类大肠癌中的表达 免疫组织化学结果显示(图2)，在正常的对照大肠组织中，NSSR1只在靠近肠腔的黏膜上皮细胞中有表达(如箭头所示)，且主要在细胞核中表达，其在黏膜腺体中无表达。然而，在大肠癌组织中NSSR1均存在显著表达，而且主要表达于肿瘤细胞核中，在胞浆中呈弱阳性。

3 讨论

大肠癌是一种严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。近年来随着生活条件及饮食结构的改变，在我国有明显上升的趋势，每年新增病例约25万，占恶性肿瘤发病率的第4位，其中在发达地区已上升到第3位。因此研究大肠癌的病理发生发展机制有十分重要的意义。目前许多研究发现，在大肠癌中存在多种基因的异常可变剪接亚型，而异常的前体mRNA可变剪接可能在大肠癌的发生发展中扮演重要角色。Thorsen等［8］发现，在大肠癌中锌离子转运蛋白 SLC39A14(solute carrier family 39，member 14)基因的 4A及4B外显子存在异常剪接;Wu等人发现，eIF 4H(eukaryotic translation initiation factor 4H)在大肠癌中也存在异常的可变剪接，且该剪接亚型与肿瘤的发生有关［10］;而 Antonacopoulou等［11］发现，survivin在大肠癌中存在异常的可变剪接亚型。因此，相关基因的异常剪接在大肠癌的发生、恶化以及转移等方面可能发挥重要作用。

图1 NSSR1在小鼠各组织中的表达Fig.1 Theexpression ofNSSR1 in mouse tissues

图2 NSSR1在人类大肠癌中的表达Fig.2 The expression of NSSR1 in human colorectal cancer

NSSR1作为一种在神经系统内显著表达的SR蛋白，主要分布在小鼠及人体神经组织中，如大脑神经元、小脑浦肯野氏细胞、视网膜双极细胞等，在神经细胞的发育分化中具有重要功能［12］。此外，NSSR1 可以调控 AMPA(alpha amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)受体亚单位GluR-B(glutamate receptor subunit B)、NCAML1，Trk c等基因的可变剪接。在细胞分裂间期以及热休克时，去磷酸化的NSSR1可以抑制前体mRNA的剪接发生，从而对防止错误剪接的产生具有重要意义［13-14］。而 Yang 等［15-16］的研究发现，NSSR1可以同TLS(translocated in liposarcoma)、EWS/FLI-1(ewing sarcoma protein/friend leukemia integration site 1)等蛋白作用，而 TLS、EWS等都是肿瘤相关蛋白，这从一个侧面反映了NSSR1可能在肿瘤的发生及发展中扮演角色。

目前，NSSR1是否在人类的肠道中有表达尚不清楚，本研究用RT-PCR和Western blot方法观测了在模式动物小鼠肠道以及其它组织中的表达情况，结果显示，NSSR1的mRNA在小鼠的各组织中均有表达，而蛋白只在神经系统表达，在肠道中无表达。在人体正常肠道组织中，NSSR1只在肠黏膜上皮细胞中表达;而在大肠癌细胞中NSSR1存在显著表达，而且主要分布在细胞核中。这一结果进一步提示NSSR1可能在肿瘤的发生、恶化以及转移中发挥作用。NSSR1在正常大肠组织的黏膜上皮细胞中有表达，这可能与上皮组织具有较强的再生能力有关，这些上皮细胞更新较快，因此细胞转录活性很高，需要较多的剪接因子表达以调控转录过程中的可变剪接。

总之，本研究结果显示NSSR1在大肠癌细胞中存在高表达，至于NSSR1的高表达在大肠癌的发生以及发展中有何生物学意义，是否可以通过调控相关的目标基因的可变剪接进而影响大肠癌的发生发展以及转移，其目标基因有哪些，调控机制如何，将是我们在接下来的研究中所需要解决的问题。

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