文拉法辛对卒中后抑郁大鼠学习记忆及海马脑源性神经营养因子的影响

代沐华，李德强，韩 阳

(浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州310003)

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是脑卒中后常见的并发症，发生率高达25% ～79%［1］。大量研究表明，PSD不仅降低卒中患者的生活质量，而且影响疾病的康复以及诱发再次卒中的可能。研究发现，35% ～82% 的卒中患者伴随至少某一方面的认知障碍，这些认知障碍不但影响卒中患者的预后［2］，而且增加患者负担［3-4］。盐酸文拉法辛是临床一线的抗抑郁药物，其抗抑郁疗效优于选择性5-羟色胺再摄取抑制剂［5-6］，对伴焦虑［7］及以躯体不适为主的抑郁患者疗效确切，但其在卒中后抑郁治疗方面的研究报道较少，尚未见对卒中后抑郁认知障碍改善的报道。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及其基因多态性不仅与抑郁障碍的发生有关［8-9］，而且与学习记忆障碍情况下海马的病理改变相关。本研究拟采用选择性右侧大脑中动脉栓塞与慢性不可预见性温和应激相结合的方法建立卒中后抑郁大鼠模型，用Morris水迷宫试验评价学习记忆功能，探讨盐酸文拉法辛对模型大鼠学习记忆的影响及海马CA3区BDNF表达变化的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理 选取清洁级SD雄性大鼠50只，体重250～300 g，随机均分为5组:对照组、模型组和3个文拉法辛治疗剂量组(5 mg·kg-1治疗组、10 mg·kg-1治疗组及 20 mg·kg-1治疗组)。依据文献［10］，用线栓法行右侧大脑中动脉栓塞手术后接受连续3周的慢性不可预见性温和应激，建立卒中后抑郁模型;用糖水偏爱试验评价抑郁模型的可靠程度。糖水偏爱试验评价参照有关文献［11］，用糖水消耗比例表示(糖水消耗量/总液体消耗量×100)。3个治疗剂量组的大鼠在进行慢性应激处理期间，在固定时段(21:00-22:00)每日1次腹腔内注射盐酸文拉法辛(美国惠氏制药有限公司)，剂量分别为:5 mg·kg-1·d-1，10 mg·kg-1·d-1及 20 mg·kg-1·d-1。药物治疗结束后所有大鼠进行Morris水迷宫试验。行为学观察结束后，大鼠经10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，取脑组织置入4%多聚甲醛固定24 h，经海马矢状切片，片厚5 μm，用SABC试剂盒行BDNF组织化学染色。

1.2 学习记忆测试 Morris水迷宫实验是经典的用于测定海马依赖的学习与记忆的方法，该系统主要包括直径150 cm、高50 cm的圆形水池，水池分为4个象限，每一象限中置一平台，平台直径9 cm，高24 cm，水面高于平台1～2 cm，水温(22±1)℃，水池正上端设计视频摄像头，附带视频摄像系统及分析软件。大鼠训练程式参照有关文献［12］，进行定位航行实验及空间探索实验。定位航行实验用于测试学习功能，空间探索实验用于测试记忆功能。在进行定位航行实验时，每天将大鼠分别从不同象限头面向池壁投入水中，计算机自动跟踪并分析大鼠寻找平台的潜伏期，如果120 s仍未找到平台，则人为引导到平台并停留30 s，此时逃避潜伏期记录为120 s。连续训练5 d，每天训练4次(分别从不同的象限入水)，每次间隔10 min。将每天记录的4次逃避潜伏期取平均值，作为大鼠当天的学习指标。5 d训练结束后，撤除平台，进行空间探索实验。将大鼠放入任一象限，分析60 s内大鼠在平台所在象限的停留时间(空间探索时间)和跨平台次数，作为记忆能力的评价指标。

1.3 海马免疫组织化学观察与BDNF阳性细胞计数 所用试剂均购自武汉博士德公司。一抗为兔抗鼠BDNF单克隆抗体，按1∶100稀释;二抗为生物素化羊抗兔IgG，即用型SABC试剂盒。严格按试剂盒说明操作。选取经过相同水平部位的海马切片，在400倍显微镜下观察并计数CA3区4个不同视野的阳性细胞数，取平均值进行统计分析。

2 结果

本实验中由于意外及术后感染等原因共死亡9只大鼠，其中模型组2只，5mg·kg-1治疗组3 只，10 mg·kg-1治疗组 3 只，20 mg·kg-1治疗组1只。

2.1 各组大鼠糖水偏爱比较 PSD模型组大鼠从接受慢性应激的第1周末一直到第3周末糖水偏爱均低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。5 mg·kg-1治疗组在应激第2周末，10 mg·kg-1治疗组及 20 mg·kg-1治疗组在应激第1周末糖水偏爱与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明本研究使用的卒中后抑郁模型是成功和有效的，经过文拉法辛治疗，PSD大鼠糖水偏爱的提高进一步证明了模型的可靠性，但是，3个治疗组间差异无统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠糖水偏爱比较Table 1 Comparison of sucrose preference among five groups

2.2 各组大鼠逃避潜伏期比较 自训练第2天开始，PSD组逃避潜伏期显著高于同时点的对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明PSD大鼠学习能力显著下降。PSD大鼠经5 mg·kg-1药物治疗后，于训练的第4天逃避潜伏期出现显著的下降，学习能力改善。10 mg·kg-1治疗组及20 mg·kg-1治疗组与模型组比较均自训练的第2天起即出现逃避潜伏期的显著下降，其作用明显高于同时段的5 mg·kg-1治疗组，差异具有统计学意义(表2)。

表2 各组大鼠逃避潜伏期比较Table 2 Comparison of escape latency time among five groups

2.3 各组大鼠空间探索时间和跨平台次数比较 五组大鼠间比较空间探索时间及跨平台次数均具有统计学差异(P＜0.05)，PSD大鼠记忆功能受损最明显，经过文拉法辛5 mg·kg-1、10 mg·kg-1及 20 mg·kg-1治疗后，PSD大鼠的记忆功能显著提高(表3)。10 mg·kg-1及20 mg·kg-1治疗组的疗效优于5 mg·kg-1治疗组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。由于空间探索时间和跨平台次数测评结果与大鼠的运动活性明显相关，本研究进一步分析了大鼠在定位航行实验及空间探索实验中的游泳速度，结果发现模型组大鼠与对照组比较，自训练第3天游泳速度开始显著下降(P＜0.05)，一直持续到记忆测试完成。10 mg·kg-1及20 mg·kg-1的文拉法辛对PSD大鼠运动激活作用明显，在定位航行试验的第3天就表现出统计学差异，而5 mg·kg-1组在第5天出现统计学意义的差异，在定位航行试验的第3天起，20 mg·kg-1治疗组即高于同时点的5 mg·kg-1组，差异具有统计学意义(表4)。

表3 各组大鼠空间探索时间及跨平台次数比较Table 3 Comparison of spatial exploring time and frequency of spanning among five groups

表4 各组大鼠在定位航行实验及空间探索实验中平均速度比较Table 4 Comparison of the average speed in place navigation and spatial probing test among five groups

2.4 各组大鼠BDNF阳性细胞观察及计数结果 BDNF阳性表达为棕色斑块，主要位于细胞质，也可位于神经突起(图1)。五组大鼠海马CA3区BDNF阳性细胞均数比较有统计学差异(F=102.53，P=0.00)。模型组明显低于对照组，而经过文拉法辛治疗的 PSD大鼠BDNF表达显著升高，且20 mg·kg-1组促进BDNF表达的能力显著高于5 mg·kg-1组，差异具有统计学意义(P＜0.05，表5)。

图1 五组大鼠海马CA3区BDNF阳性表达Fig.1 BDNF expression in hippocampus CA3 area among five groups

表5 高倍镜视野下(×400)五组大鼠海马CA3区BDNF阳性细胞数Table 5 Comparisons of BDNF+cells in CA3 area under high-power field(×400)among five groups

3 讨论

近来很多学者致力于抑郁障碍发病机制的研究。如慢性不可预见性温和应激抑郁模型的发展，海马脑源性神经营养因子表达的下调与神经再生障碍介导的抑郁行为假说的提出，都使其研究得到了完善和发展。PSD指发生于脑卒中后的抑郁状态，临床表现的核心症状为情绪低落、兴趣减少、快感缺乏和精力减退。PSD作为抑郁障碍的一种特例，由于显著影响卒中患者生活质量及康复效果，已引起了国内外学者的重视。PSD的发生不仅与脑损伤直接相关，而且与卒中发生时的急性应激及卒中后的一系列慢性应激有关系。大量研究表明，应激在抑郁障碍的发病中起重要作用，由于卒中与应激互为因果并常常伴随出现，临床难以将二者截然分开加以研究。随着卒中后抑郁动物模型建立技术的日益成熟，为深入研究相关的机制奠定了基础。选择性右侧大脑中动脉栓塞后结合慢性不可预见性温和应激和孤养已成为广泛使用的建立卒中后抑郁动物模型的一种方法，该方法建立的抑郁模型能够较高效地模拟人类的抑郁行为，且抑郁程度可通过糖水偏爱或敞箱试验衡量［13］。糖水偏爱试验测试抑郁动物对奖赏刺激的反应性，可反映愉快感缺失这一抑郁的核心症状。敞箱试验反映了抑郁动物精神运动性抑制的特性。由于敞箱试验的影响因素较多而不易控制，而糖水偏爱试验操作简便，影响因素较少，所以更多的学者使用糖水偏爱试验评价抑郁程度。迄今为止，一线的增强单胺能神经递质功能的多种抗抑郁药物均可借助慢性应激模型检测抑郁动物的糖水摄入量［14］，提示5-羟色胺、去甲肾上腺素等单胺能神经递质介导抑郁模型的药理作用。本实验中模型组大鼠在缺血手术后进行慢性不可预见性温和应激处理中表现出糖水偏爱程度进行性下降的趋势，表明大鼠愉快感的下降。在水迷宫试验中模型组大鼠游泳速度明显低于对照组，表明了运动活性的下降。这些症状证实本研究中使用的抑郁模型是成功的，在给予文拉法辛治疗后，PSD大鼠糖水偏爱程度及运动活性均显著提高，进一步证实该模型是可靠的。

海马不仅与学习、记忆及情感等高级认知功能密切相关，而且是抑郁障碍多重发病因素的共同交汇点，并介导神经系统结构与功能的可塑性改变。本研究用经典的学习记忆的行为学评价方法，即Morris水迷宫试验评价PSD大鼠的认知改变，结果证实PSD大鼠学习记忆能力显著下降。虽然目前对学习记忆的确切机制尚不清楚，但多数学者认为海马或其邻近部位如杏仁核损伤所导致的突触联系中断可能是学习与记忆障碍发生的主要原因。Morris水迷宫试验中大鼠能够顺利找到隐藏的平台并将平台所在位置的信息保存下来，有赖于海马的正常功能。寻找与学习记忆相关的底物一直是医学科学家感兴趣的课题。动物学习过程与信息保持过程与BDNF有一定关系［15］。最近的研究表明，BDNF可促进海马神经再生，逆转突触丢失，稳定基因表达，改善细胞信号转导，恢复学习与记忆功能［16］。最近发现，慢性不可预见性温和应激大鼠脑内BDNF表达上调可能是抗抑郁药发挥治疗作用的一种机制，持续的抗抑郁治疗几乎都能使海马和前额叶皮层BDNF的表达增加［17］;而且BDNF表达异常可能对认知障碍产生久远的影响。已有研究［18］表明，接受慢性不可预见性温和应激的母鼠所生的子鼠海马BDNF表达下降，其病理生理改变与大鼠在水迷宫试验中记忆受损相一致。

文拉法辛属于去甲肾上腺素与5-羟色胺再摄取抑制剂，通过双受体机制促进海马BDNF的表达和神经再生而发挥抗抑郁和改善认知的作用。本研究虽然不确定文拉法辛改善认知功能的作用是直接的，还是通过改善抑郁后间接地改善认知缺陷，但有研究发现文拉法辛在促进大鼠额叶皮层及海马组织BDNF表达的同时，抑制海马CA1区长时程增强［19］，这说明文拉法辛有可能直接作用于BDNF，从而改善依赖海马的学习记忆障碍。由于动物实验已经证实日剂量最低4 mg·kg-1就可引出明显的行为与药理学效应［20］;因此，本研究选择了日剂量分别为 5 mg·kg-1、10 mg·kg-1及 20 mg·kg-1的3个剂量组，观察不同剂量文拉法辛对PSD大鼠学习记忆的改善作用和海马CA3区BDNF的表达改变。本研究结果显示，5 mg·kg-1治疗组对学习能力改善作用出现在定速航行试验的第4天，而10 mg·kg-1治疗组及20 mg·kg-1治疗组疗效出现在第2天，并一直持续到学习测试结束，而且，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1组改善学习障碍的能力显著高于同时点的5 mg·kg-1组，说明随着文拉法新剂量增加，改善学习能力的疗效更好且起效时间更早。在记忆能力的测试中也出现类似的结果。临床和基础的药动学与药效学研究均提示文拉法辛在一定范围内其剂量—效应关系呈线性，但是随着剂量的进一步升高，除作用于5-羟色胺及去甲肾上腺素递质外，还可作用于多巴胺能神经递质，增强上述3种递质的功能［21］，这一药理机制决定了其超过某一临界值以上的非线性剂量—效应关系。我们注意到在空间探索时间比较时，虽然20 mg·kg-1组与10 mg·kg-1组比较无统计学差异，但其改善记忆障碍的能力似乎有下降的趋势。这一有趣的现象一方面反映出文拉法辛总体非线性的量效关系;另一方面，可能由于20 mg·kg-1组大鼠运动活性最强，运动速度最快，在增加跨平台次数的同时，在非平台所在象限的活动范围增加，导致4个象限的运动时间趋于平均化，反而绝对减少了平台所在象限的停留时间。

不同组海马CA3区BDNF免疫组化分析表明，PSD大鼠BDNF表达显著下降，文拉法辛可促进CA3区BDNF的表达，这与多数学者的研究结果一致。随着文拉法辛剂量的增加，BDNF的表达也逐渐升高，20 mg·kg-1组免疫组化产物显著高于5 mg·kg-1组，这一结果与学习记忆能力的变化趋势一致。相同的变化趋势表明文拉法辛可能通过BDNF的介导改善PSD大鼠学习记忆障碍，但海马BDNF表达与认知功能改变是因果关系还是一种并列关系，在本实验中尚无法定论。最近的一项研究［22］报道，文拉法辛减少强迫游泳大鼠的抑郁行为，但是，慢性不可预见性温和应激暴露与海马齿状回及CA3区mRNA表达升高有关系，作者提出虽然抑郁行为本身与BDNF并不是简单的一对一的关系，但抗抑郁治疗能够使 BDNF mRNA表达增加。本研究结论与其不一致的原因可能来自:①使用的动物模型不同;②BDNF检测方法差异;③海马BDNF表达与抑郁行为之间可能存在复杂的时间空间关系。

本实验中文拉法辛促进卒中后抑郁大鼠海马BDNF表达，改善学习记忆障碍，其机制可能与BDNF抑制NMDA对海马的神经毒作用［23］，抑制神经凋亡促进其再生［24］，以及通过单胺能神经递质与乙酰胆碱［25］、一氧化氮［26］甚至神经肽［27］等递质系统的相互作用有关，确切的机制尚待进一步研究。

总之，本研究观察了不同剂量的文拉法辛对脑缺血合并慢性不可预见性温和应激模型大鼠的学习记忆障碍的改善作用，结果证实文拉法辛能改善卒中后抑郁症状，提高学习记忆能力，其作用可能与增加海马CA3区BDNF的表达有关。下一步我们将增加样本量，对卒中后抑郁大鼠脑内BDNF进行预处理，比如通过基因导入或基因敲除的方式，阻断其表达，观察文拉法辛对PSD大鼠认知功能的影响。

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