高甘油三酯血清对人脐静脉内皮细胞的损伤作用

居峰 吴剑吴文宏周晓霞

（1江苏省靖江市人民医院，江苏 靖江 214500；2扬州大学医学院，江苏 扬州 225001）

近年来，心脑血管疾病己成为当今世界上威胁人类健康最严重的疾病之一，其中动脉粥样硬化（arteriosclerosis，AS）的发病率和死亡率位居前列。血管内皮细胞损伤导致的内皮功能障碍不仅是AS的一个始动环节，还是导致其不断进展的重要因素。因此，改善和恢复血管内皮功能已经成为AS防治的重要目标之一。

在众多导致AS的危险因素中，高甘油三酯血症（HTG）与AS的关系则一直颇有争议。近年来，国内外一些新的流行病学研究资料及病理学研究表明，HTG是AS发生的独立危险因素并在AS斑块中发现有富含甘油三酯脂蛋白的类似物存在[1]。然而，在细胞水平上，高甘油三酯血清（High triglyceride blood serum，HTGBS）是否可直接导致血管内皮细胞的氧化损伤的相关研究报道甚少，故本研究采用体外培养人脐静脉内皮细胞（human vascular endothelial cell，HUVEC），观察单纯HTGBS对血管内皮细胞活力、通透性、氧化及抗氧化能力和分泌功能等方面的影响。

近年来，血红素氧化酶-1/一氧化碳（hemeoxygenase-1，HO-1/CO）系统在心血管疾病中的作用受到了广泛的关注。HO-1与其作用产物CO、铁、胆绿素、胆红素涉及许多生理和病理过程。本文将在细胞水平上初步观察HTG所致HUVEC氧化损伤对HO-1/CO系统的影响，进一步探讨HTGBS致AS的机制。

1 实验材料

HUVEC细胞株由南京医科大学提供；DMEM购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；MTT购自Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；HO-1（M-19）购自Santa Cruz公司。

2 实验方法

2.1 HTGBS的收集与处理

从医院收集人的正常血清及HTGBS，分别置于56℃水浴30 min灭活处理，并用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。血清中的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）及血糖（GLU）指标均由医院检验科全自动生化分析仪检测。

2.2 HUVEC的传代培养

将HUVEC细胞株培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中。待细胞生长至近汇合状态、铺满瓶壁80%以上时，进行传代。

2.3 MTT法检测HTGBS对HUVEC活力的影响

2.3.1 实验分组

①阴性对照组：5%人正常血清；

②梯度浓度的HTGBS组：分别含HTGBS 1%、2%、3%、4%、5%（血清终浓度为5%，不足5%的部分用人正常血清补充）；

③空白对照组：5%人正常血清（不加细胞只加培养基）。

2.3.2 操作步骤 细胞以5×104/mL密度接种于96孔培养板，用含5%人正常血清的DMEM培养24 h后，换无血清DMEM（每组6孔）继续培养。静止培养24 h后按分组加入含不同浓度血清培养液继续培养24～48 h；实验结束后每孔加入 MTT溶液（5 g/L）20 μL，37℃继续孵育 4 h，弃去培养液，每孔加150 μL DMSO，振荡均匀后于酶标仪490 nm波长测吸光度（absorbance，A）值。

2.4 细胞中LDH活性、MDA含量和SOD活性的测定

分组同上，按说明书采用化学比色法测定细胞中LDH活性；硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法测定MDA含量；黄嘌呤氧化酶法检测细胞内SOD活性。

2.5 细胞中NO含量、总一氧化氮合酶（TNOS）和诱导型NOS（iNOS）活性的测定

分组同上，用硝酸还原法测定细胞血管内NO含量；用化学比色法测定内皮细胞中TNOS和iNOS活性。

2.6 ELISA测定碳氧血红蛋白（Carboxyhemoglobin，COHb）的含量

溶液中的CO很容易与血红蛋白结合生成 COHb，通过测定培养基中COHb含量可以间接反映CO的生成，COHb测定参照Morita等[2]方法：消化单层培养细胞，以5×104/mL密度接种于96孔培养板中，用含5%人正常血清的DMEM培养24 h后，换无血清DMEM静止培养24 h，实验分组同上（每组6孔），加入血清后继续培养24 h。实验结束前1 h每孔加入牛血红蛋白50 μmol/L，选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔培养上清液的A值。

2.7 Western Blot检测蛋白表达

细胞以5×104/mL密度接种于50 mL培养瓶，用含5%人正常血清的DMEM培养24 h后，换无血清DMEM静止培养24 h，实验分组同上，加入血清后继续培养24 h。细胞收集在1.5 mL EP管，按说明书加入RIPA裂解液和PMSF，冰上裂解 30 min，4℃，12 000 rpm/min 离心 15 min，收集上清转移到0.5 mL EP管，每组取100 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳。PVDF膜湿转（Bio-Rad），350 mA转100 min，室温封闭 1 h，一抗 4℃冰箱孵育过夜（1∶500），洗膜后二抗室温孵育2 h（1∶500），洗膜后二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。

2.8 统计学处理

运用SPSS 10.0软件进行统计学处理分析，计量资料以±s表示，两组数据间比较用t检验，多组间比较用方差分析。

3 实验结果

3.1 人血清中 TC、TG、GLU的含量

与正常血清相比，单纯HTGBS中仅TG明显升高（P＜0.01），其余指标属于正常范围，见表1。

表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量（±s）

表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量（±s）

注：与正常血清组相比：*P＜0.01

分组（n=100）TC（mmol/L）TG（mmol/L）GLU（mmol/L）正常血清 4.51±0.03 1.25±0.02 5.2±0.13高甘油三酯血清 4.68±0.02 3.58±0.02* 5.0±0.10正常范围 2.3～5.7 0.55～1.82 3.9～6.1

3.2 相差显微镜下HUVEC形态

正常血管内皮细胞生长状态良好，贴壁较牢，细胞间连接紧密；细胞呈多角形或短梭形，边界清楚，大小均匀，呈单层铺路石样镶嵌排列；胞核圆形或椭圆形，位于细胞中央，多核仁；胞浆丰富（图1）。

图1 倒置相差显微镜下HUVEC形态（×100）

3.3 MTT法检测HTGBS对HUVEC活力的影响

经无血清抑制处理的HUVEC给予含5%正常血清（Control组）和含 1%、2%、3%、4%、5%HTGBS的细胞培养液继续培养24、48 h后490 nm处测得吸光度值，结果如图2所示：1%，2%，3%的HTGBS可小幅度促进HUVEC增殖，但4%、5%HTGBS明显抑制HUVEC活力，与正常对照组相比有统计学意义 （P＜0.01）。由此确定HTGBS致HUVEC损伤的最佳实验浓度5%，最佳作用时间为24 h。

图2 不同浓度的HTGBS对HUVEC活力（MTT法测A值）的影响（±s,n=6）

3.4 HTGBS对HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影响

测定结果如表2所示：与正常对照组相比，HTGBS使得细胞培养液中LDH活性明显升高（P＜0.01）；血管内皮细胞中SOD活性降低，膜脂质过氧化产物MDA含量明显增加（P＜0.01）。

表2 HTGBS对HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影响（±s）

表2 HTGBS对HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影响（±s）

注：与Control组相比：*P＜0.01

分组(n=6)LDH(U/g prot)MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)Control 0.128±0.014 0.261±0.033 20.083±1.909 HTGBS 0.277±0.030* 0.682±0.059* 15.959±2.084*

3.5 HTGBS对HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影响

测定结果如表3所示：与正常对照组比较，HTGBS使HUVEC中NO含量、TNOS活性明显降低（P＜0.01）；iNOS活性升高（P＜0.01）。

表3HTGBS对HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影响（±s）

注：与Control组相比：*P＜0.01

3.6 HTGBS对HUVEC中HO-1蛋白表达及细胞培养液中COHb含量的影响

测定结果如表4，图3所示：与正常对照组比较，HTGBS组HUVEC中HO-1蛋白表达代偿性升高，细胞培养液中的COHb含量明显增加（P＜0.01）。

表4 HTGBS对HUVEC中HO-1蛋白表达及细胞培养液中COHb 含量的影响（±s）

表4 HTGBS对HUVEC中HO-1蛋白表达及细胞培养液中COHb 含量的影响（±s）

注：与Control组相比：*P＜0.01

分组(n=6)HO-1蛋白表达(A值之比)COHb含量(A值)Control 0.640±0.042 0.136±0.016 HTGBS 0.828±0.063* 0.275±0.023*

图3 HTGBS对HUVEC中HO-1蛋白表达的影响（±s,n=6)

4 讨论

AS已经成为严重威胁人类健康的常见疾病。其发病机制复杂，诸多因素参与其中，而内皮细胞损伤作为始动环节之一已被公认[3]。内皮细胞形态和结构的完整性是维持内皮正常功能的前提，内皮细胞损伤的原因较多，高脂血症作为引发动脉粥样硬化及心脑缺血性疾病的重要因素之一，主要在于其对内皮细胞的损伤作用。高脂血症可表现为高胆固醇血症（HTC）、HTG或两者兼有。现有的文献关于HTC与AS的关系研究比较透彻，而HTG与AS的关系则一直颇有争议。我国膳食以高糖低脂为特点，血脂紊乱以内源性甘油三酯升高最为多见，因此研究HTG在AS发病中的作用机制及其防治具有特别的重要意义。郑关毅等[4]的研究表明，单纯性HTG患者和高血压伴HTG的病人存在脂质过氧化反应增强、抗氧化酶活性降低。目前已有实验研究[5]证实，HTG患者及实验性HTG动物体内均存有明显的脂质过氧化损伤，包括血浆脂质过氧化物以及氧化修饰脂蛋白如氧化修饰低密度脂蛋白（LDL）、氧化修饰极低密度脂蛋白（VLDL）等含量增加。这些氧化修饰的脂蛋白均可以损伤血管内皮细胞，促进AS的形成。

MTT法是一种检测细胞存活和生长增殖情况的方法，细胞活力（A值）能间接反映细胞的增殖和存活情况。LDH是糖酵解过程中一种重要的酶，广泛存在于细胞浆中，当细胞膜损伤、通透性增加时，胞浆中的LDH才大量释放到细胞外，因此细胞培养液中LDH活性的高低是反应细胞受损伤程度的一个非常灵敏的指标。本实验结果表明1%、2%、3%的HTGBS虽可小幅度促进HUVEC增殖，但没有统计学意义，但4%、5%HTGBS明显抑制血管内皮细胞活力，与正常对照组相比有统计学意义（P＜0.01），因此以本实验为基础，确定以含5%HTGBS为最佳实验浓度；HTGBS组细胞培养液中LDH活性明显高于正常对照组（P＜0.01），本实验结果表明HTGBS可使血管内皮细胞活力降低并致细胞损伤使其通透性增加。

MDA是细胞膜脂质过氧化的最终分解产物，其含量的多少可反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是机体内抗氧化酶系统的重要组成部分，主要清除O-2，抑制脂质过氧化反应。SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，对两者结果分析具有一定生物学意义。本实验研究结果表明，HTGBS组细胞中SOD活性明显低于正常对照组（P＜0.01），MDA含量明显高于正常对照组（P＜0.01），提示HTGBS可显著增加脂质过氧化物含量并降低细胞的抗氧化能力。

正常生理情况下NO是由血管内皮细胞合成分泌的一种重要的信使分子和效应分子，执行重要的生物功能，包括扩张血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌细胞增殖等，其生物合成主要受NOS的调节。生物组织中已经确定的NOS亚型有3种：神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）、iNOS，前两者又合称为结构型 NOS（cNOS），三者总称TNOS。

在AS病变发展过程中，内皮功能受损，内皮源性cNOS表达或活性下降，内皮源性NO产生减少，而iNOS活性增加，产生大量NO自由基，刺激细胞凋亡和胶原组织降解，促进AS的形成，NO自由基还可与O-2反应形成过氧化亚硝酸盐，引起组织损伤。NOS在AS的发病机制方面有着双重作用：在正常情况下，eNOS催化产生低浓度的NO，这对机体抗AS是有益的[6-8]；然而在高脂血症、AS时，它通过依赖于四氢生物嘌呤（BH4）途径而形成超氧化物[9-10]。如果再加上局部iNOS的活化，将会导致粥样硬化斑块内高浓度的有细胞毒作用的过氧化亚硝酸盐形成。最近 Bohr-Roussel、Böger RH等[11-12]给高胆固醇喂养的兔长期应用iNOS特异的抑制剂2周后，发现AS斑块、主动脉内膜/中膜比例与正常对照组相比无差异，这表明iNOS抑制剂确能限制高胆固醇兔的AS进程。本实验研究结果表明，HTGBS组HUVEC中内皮依赖性舒张因子NO含量、TNOS活性与正常对照组相比明显降低（P＜ 0.01）；i-NOS活性与正常对照组相比明显升高（P＜0.01）。初步提示HTGBS可以通过降低TNOS的活性，增加iNOS活性，直接或间接地减少内源性NO的合成与释放。

HO是血红素降解起始酶和最为重要的限速酶。它降解血红素产生CO、胆绿素和铁离子。HO在人体内广泛存在，参与多种生理和病理过程，与心血管疾病有着密切的联系。HO-1源性的CO在氧化应激状态下，可通过调节心脑血管系统的紧张度，发挥心脑血管保护作用[13]。本实验在细胞水平上初步观察HTGBS所致HUVEC氧化损伤对HO-1/CO系统的影响，Western Blot结果显示，与正常对照组比较，HTGBS组HUVEC中HO-1蛋白表达代偿性升高，细胞培养液中的CO含量明显增加，实验结果初步提示，HTGBS损伤的HUVEC中HO-1表达上调是细胞代偿性保护性反应。

综上所述，HTGBS不仅能降低细胞的抗氧化能力，增加脂质过氧化物的生成损伤血管内皮细胞，代偿性上调细胞HO-1蛋白表达，并且可以通过影响NO/NOS系统从而导致血管内皮功能障碍。

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