活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达的影响

白云，孙强，包顺茹，章艳

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

缺血性脑血管疾病又称脑缺血，是一种严重危害老年人健康和生存质量的常见病，具有发病率高、致残率高、预后差、易复发等特点，居脑血管病死亡原因之首，因而对缺血性脑血管疾病的研究就显得十分迫切［1］。脑缺血在中医学中属“中风”范畴。中风的中医药治疗历史悠久，中药由于多成分、多层次和毒副作用小、协同作用强的特点，在脑缺血的预防、治疗与康复方面呈现显著优势［2－3］。本课题组以“瘀血生风”假说为基础，提出活血熄风方。此方经临床实践验证，对中风患者具有确切疗效。本课题组在前期已经证实活血熄风方对脑缺血具有神经保护作用的基础上［4－5］，通过检测对模型大鼠脑组织 NF － κBp65蛋白的表达情况，以期进一步明确活血熄风方抗脑缺血的作用机制，为研发出作用机制明确而安全有效的抗脑缺血中药新药奠定实验基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar大鼠，体质量为270～350g，雄性，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。在室温18℃ ～25℃、相对湿度40%～60%的环境中适应性饲养1周。大鼠手术前12h开始禁食，自由饮水。

1.2 药品、试剂

活血熄风方(由当归、红花、川芎等组成，黑龙江中医药大学药理教研室制备);银杏叶片(批号101108，唐山荣大药业有限公司);尼莫地平片(批号101201，西安博爱制药有限公司);PV6001二步法检测试剂盒(北京中杉生物技术有限公司);NF－κBp65抗体(美国SANTA Cruz公司)。

1.3 实验仪器

Q500IW图像分析仪(德国Leica);生物组织包埋机(湖北孝感)。

2 实验方法

2.1 动物分组

将Wistar大鼠随机分成活血熄风方高剂量组、中剂量组、低剂量组，银杏叶片组，尼莫地平组，模型对照组和假手术组。除假手术组10只外，其余每组16只。

2.2 给药方法

活血熄风方高、中、低剂量组分别灌胃给予活血熄风方10g/kg、5g/kg、2.5mg/kg;银杏叶片组灌胃给予银杏叶片135mg/kg;尼莫地平组灌胃给予尼莫地平片21.6mg/kg;模型对照组及假手术组灌胃给予等量生理盐水。各组大鼠均连续灌胃给药7天。

2.3 右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)模型制作

于末次给药30min后，进行右侧MCAO阻塞模型手术。参照Longa［6］方法，并稍加改良，10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠仰卧位固定后，行颈正中线切口，分离左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，在颈总动脉远心端和近心端及颈外动脉处分别挂线备用。用蛙心夹夹闭颈内动脉，近心端结扎颈总动脉和颈外动脉，距颈总动脉分叉部4～5mm处剪一小口，随后打开蛙心夹，用眼科镊子轻推拴线(直径0.23～0.25mm、长3cm的鱼线)，直至插入到颈内动脉中大约18mm左右，稍微感到阻力后停止进线，系牢颈总动脉远心端的细线，将伤口缝合，单笼饲养。

2.4 神经功能评分

MCAO手术后，于大鼠意识恢复30min时，对各组大鼠进行神经功能缺陷评分。计分在1～3分者纳入研究，每组选择8只进行以下实验。

2.5 大鼠脑组织NF－κBp65蛋白含量测定

上述评分合格大鼠，以10%水合氯醛(剂量为350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，立即开胸暴露心脏，将右心耳剪掉，经左心室插管至升主动脉，将大约150ml肝素化生理盐水于5min内全部灌注于左心室中。随后灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲溶液200ml。灌注完毕后，从大鼠枕骨大孔剪开，完整取出大鼠脑组织，于4℃相同固定液中固定，制作病理组织切片。随后参照试剂盒说明书，以PV－6001二步法进行操作。

2.6 结果判定

采用光学显微镜观察大鼠脑组织皮质区，以细胞核出现鲜艳的棕黄色染色颗粒的细胞为阳性细胞，每张切片高倍镜下随机选择不重合的5个视野，采用图像信号采集与分析系统拍照并计数每个视野中阳性细胞数，计算平均值。

2.7 统计学处理

以SPSS11.5 for Windows统计软件分析处理实验结果，采用方差分析，所得数据用(±s)表示。

3 实验结果

实验结果显示，模型对照组与假手术组相比，模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达有明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。同时活血熄风方高剂量组、中剂量组、低剂量组及尼莫地平组、银杏叶片组分别与模型对照组相比，模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达亦有增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。(结果见表1、图1)。

图1 活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质

表1 活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达的影响(±s)

表1 活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达的影响(±s)

注:与模型对照组相比，*P＜0.05;模型对照组与假手术组相比，▲P ＜0.05。

组别 n 剂量(mg/kg)阳性细胞数假手术组 8 等体积28.49 ±12.81模型对照组 8 等体积 42.08±6.56▲活血熄风方高剂量组 8 10 35.18 ±4.70*活血熄风方中剂量组 8 5 33.11 ±6.22*活血熄风方低剂量组 8 2.5 34.70 ±7.46*银杏叶片组 8 135 34.37 ±7.12*尼莫地平组 8 21.6 35.04 ±3.72*

4 讨论

脑缺血是多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应，其病理生理机制非常复杂，因此从中药中寻找多靶点、多途径、多效应的脑缺血治疗药物是一条有效途径。本研究以“瘀血生风”假说为理论基础，提出活血熄风方。此方由当归、红花、川芎等多味中药组成，具有活血化瘀、熄风止痉之功效。经多年临床实践证实，对脑缺血患者具有较好疗效。为进一步探讨活血熄风方抗脑缺血的作用机制，本研究通过观察活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达的变化，旨在为研发出作用机制明确、安全有效的防治脑缺血的中药新药提供实验依据。

NF－κB存在于神经细胞、神经胶质细胞和脑血管内皮细胞中，是一种氧化应激反应性转录因子。当机体发生缺血性脑损伤时，机体产生将一系列内源性因子参与到活化NF－κB的过程中。活化后的NF－κB可以促使即早基因、粘附分子、细胞因子和细胞表面受体等的表达。当发生急性脑缺血时，在粘附分子的介导下，白细胞在血管内皮细胞中滚动、粘附并且外漏，从而引发炎症级联反应［7－10］。因此，NF － κB 被认为是血管内皮细胞受损的始动机制之一。本研究中通过观察活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质NF－κBp65蛋白表达的变化，发现活血熄风方能抑制MCAO模型大鼠脑皮质NF－κBp65的表达。由此，我们推测活血熄风方对MCAO模型大鼠脑皮质神经保护的作用机制可能与其抑制NF－κBp65蛋白的表达有关。然而NF－κBp65是否参与了活血熄风方对MCAO模型大鼠的神经保护作用，亦或只是其伴随现象，尚需今后通过实验进一步证实。

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