山茱萸不同提取部位对几种化学致损肝、肾细胞影响的研究

顾海，房德房，杜伟蜂，蔡宝昌，詹瑧，王明艳

(1.南京中医药大学，江苏南京210029;2.连云港中药学校，江苏连云港222006;3.浙江中医药大学，浙江杭州310053)

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，其临床常用的饮片有山萸肉、酒山萸肉。生品长于敛汗固脱，用于自汗或大汗不止，阴虚盗汗;酒蒸后补益肝肾作用增强，多入滋补剂，常用于眩晕耳鸣，阳痿遗精，遗尿尿频，月经过多或崩漏，腰部酸痛，大汗虚脱，内热消渴等症。课题组前期动物实验结果表明［1－6］:山茱萸及其提取部位对小鼠衰老模型及其它病理损伤模型有一定的影响，表现在对肝脏、肾脏的保护作用，能提高免疫功能等。本研究以离体肝细胞、肾细胞等为研究对象，制备化学损伤模型，观察山茱萸不同提取部位在细胞层面的作用，以补充说明整体实验，同时为进一步进行机理探讨打基础。

1 实验材料

1.1 试剂

RPMI－1640培养粉(GIBCO，USA);小牛血清(杭州四季青);胰蛋白酶(Typrin，1:250，Amerso，USA);MTT(上海伯奥生物科技公司);二甲基亚砜(分析纯，MERCK)。

1.2 细胞

人肝细胞L－02:南京大学生命科学学院馈赠;大鼠肾小球系膜细胞株HBZY－1由武汉细胞生物研究所提供。

1.3 仪器

超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪。

2 实验方法

2.1 供试药液制备

山茱萸水煎液的制备:分别取一定量的山茱萸生品、制品，用10倍量蒸馏水煎煮1h，趁热抽滤，药渣加10倍量蒸馏水煎煮1h，趁热抽滤，合并滤液，60℃旋转蒸发浓缩。

取一定量水煎液加乙醇至浓度达80%，冰箱中静置24h醇沉，抽滤得醇沉粗多糖部位和醇溶部位，醇沉粗多糖部位于50℃真空干燥至恒重，精密称定山茱萸多糖的重量备用;醇溶部位再依次用二氯甲烷、正丁醇萃取，余下为水部位。

山茱萸总提物的制备:分别取一定量的山茱萸生品、制品，用10倍量95%乙醇回流提取1.5h，趁热抽滤，药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h，趁热抽滤，药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5h，趁热抽滤，合并滤液，60℃旋转蒸发浓缩。

取山茱萸总提物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，挥干溶剂即得相应的溶剂萃取部位。

用溶剂二甲基亚砜将上述不同提取部位溶解后制成母液，根据各部位实际得率折算成生药浓度，用0.22μm的微孔滤器过滤除菌，置－20℃备用。临用时根据生药临床用量，换算出离体细胞的用量，用单培稀释母液(使作用于细胞的药液终浓度相当于0.278g生药/L，且二甲基亚砜含量小于0.5%)。

2.2 细胞培养

几种细胞株根据其对血清和pH的要求，配制RPMI 1640培养液，按常规方法培养，严格无菌操作。

2.3 造模方式 根据文献报道，选择不同的致损化合物，制备细胞损伤模型如表1。

表1 致损细胞模型

2.4 实验分组 实验分组情况如表2所示。

表2 实验分组情况

2.5 形态学观察

取处于指数生长期的细胞，加入一定量的0.25%胰酶消化，用含一定量的新生牛血清的RPMI 1640全成分培养液配成悬液，用血球细胞板计数，稀释细胞，配成2×105个/mL悬液，加入6孔细胞板，培养后用无血清培养液处理细胞，按药液与单培1∶10的比例加入药液，在37℃，5%CO2的培养箱中孵育24h后倒置显微镜观察。

2.6 MTT 检测

同上，取处于指数生长期的细胞，制备细胞悬液(2×105个/mL)，加入96孔细胞板，培养后用无血清培养液处理细胞，按药液与单培1∶10的比例加入药液，每个剂量重复6～8孔，在37℃，5%CO2的培养箱中孵育24h后，加入50μl用PBS配成的1mg/mL MTT溶液，37℃温育4h，使MTT还原为formazan，弃细胞上清，加入100μl DMSO使formazan溶解，混悬仪混匀后用酶标仪在490nm处测定每孔光密度。

3 实验结果与讨论

3.1 H2O2、CdCl2对 L02、HSZY －1细胞生长造成的影响 如图1所示。

图1 倒置显微镜照片

由图1可见，H2O2、CdCl2分别对 L02、HSZY －1细胞生长有影响，表现在模型组细胞稀少，部分出现细胞变圆，细胞核染色质固缩的凋亡特征。山茱萸不同萃取部位表现出形态学保护作用。

3.2 山茱萸不同萃取部位对几种化学致损细胞保护作用的MTT实验结果 如表3所示。

由表3可知，山茱萸生、制品提取部位对化学致损细胞表现出保护作用，有的对H2O2、CCl4所致肝细胞损伤有保护作用;有的对CdCl2所致肾细胞损伤有保护作用;其中山茱萸制品水煎液、山茱萸制品总提液、山茱萸制品水煎液正丁醇萃取部位、山茱萸制品总提液正丁醇萃取部位对几种化学致损的肝、肾细胞模型均表现出保护作用，且制品其作用优于生品，山茱萸制品总提液石油醚萃取部位对肝细胞保护作用明显。

表3 山茱萸不同提取部位对几种化学致损细胞保护作用(±s)

表3 山茱萸不同提取部位对几种化学致损细胞保护作用(±s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

OD值(×10－1)组别 L02(H2O2) L02(CCl4) HSZY－1(CdCl2)模型组1.28 ±0.06 1.44 ±0.23 1.54 ±0.10细胞对照组 2.27±0.05＊＊ 3.49±0.15＊＊ 1.87±0.5*用药组1 1.17 ±0.40 2.06 ±0.21* 2.46 ±0.12＊＊用药组2 1.68 ±0.18* 2.13 ±0.23* 2.25 ±0.17*用药组3 1.73 ±0.07＊＊ 1.90 ±0.55 1.96 ±0.03＊＊用药组4 1.52 ±0.01* 1.82 ±0.17* 2.25 ±0.50用药组5 1.40 ±0.03 1.77 ±0.26 2.46 ±0.94用药组6 1.85 ±0.28 1.94 ±0.25* 2.05 ±0.23*用药组7 2.18 ±0.98 1.64 ±0.19 1.85 ±0.10＊＊用药组8 1.53 ±0.28 1.67 ±0.11 2.00 ±0.03＊＊用药组9 1.92 ±0.33 1.75 ±0.11* 2.21 ±0.05*用药组10 1.79 ±0.13* 2.03 ±0.11＊＊ 2.01 ±0.06＊＊用药组11 1.75 ±0.05＊＊ 2.47 ±1.02 2.12 ±0.14＊＊用药组12 1.92 ±0.30 2.07 ±1.15 2.62 ±1.18用药组13 2.17 ±1.00 1.65 ±0.11 1.90 ±0.11*用药组14 1.90 ±0.14＊＊ 1.91 ±0.13* 1.87 ±0.06＊＊用药组15 1.70 ±0.21 1.68 ±0.11 1.92 ±0.02＊＊用药组16 1.69 ±0.11＊＊ 1.53 ±0.08 1.91 ±0.11＊＊用药组17 1.73 ±0.13* 1.83 ±0.17* 2.16 ±0.22*用药组18 1.67 ±0.12* 2.14 ±0.12＊＊ 2.20 ±0.02＊＊用药组19 1.81 ±0.16* 1.85 ±0.26 2.15 ±0.17*用药组20 1.79 ±0.17* 1.69 ±0.19 2.02 ±0.07＊＊用药组21 1.23 ±0.05 1.47 ±0.03 1.90 ±0.09＊＊用药组22 1.26 ±0.05 1.41 ±3.00 1.78 ±0.26用药组23 1.22 ±0.03 1.45 ±0.11 2.00 ±0.27用药组24 1.30 ±0.09 1.34 ±0.14 1.77 ±0.08*

前期药理实验结果表明:山茱萸生、制品及其提取部位具有保肝肾、增强免疫的功能，其中制品的作用优于生品［2］。山茱萸正丁醇、石油醚萃取部位有补肝肾作用，且制品作用优于生品，本实验结果提示，山茱萸生、制品及多种提取部位对化学致损肝、肾细胞有直接保护作用，其中山茱萸制品水煎液、山茱萸制品总提液、山茱萸制品总提液正丁醇萃取部位、山茱萸制品水煎液去多糖正丁醇萃取部位及山茱萸制品总提液石油醚萃取部位作用明显，该结果验证了动物实验，进一步说明:山茱萸及其提取部位补肝肾作用包括细胞层面的直接保护作用，该研究为以细胞损伤模型作为研究对象，进一步提取分离活性成分打下基础。

［1］ 余宗亮，丁霞，蔡宝昌，等.山茱萸炮制前后对小鼠免疫功能的影响［J］.中医药学刊，2006，24(8):1445.

［2］ 李俊松，余宗亮，王明艳，等.山茱萸炮制前后对小鼠急性肝损伤保护作用的研究［J］.南京中医药大学学报，2008，24(4):236－238.

［3］ 丁霞，王明艳，余宗亮，等.山茱萸中5－羟甲基糠醛的分离鉴定及生物活性研究［J］.中国中药杂志，33(4):392－396.

［4］ 杜伟锋，王明艳，蔡宝昌.山茱萸炮制前后多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.中药材，2008，31(5):715 －717.

［5］ 许惠琴，刘洪，沈健，等.山茱萸环烯醚萜总苷对AGEs培养肾小球系膜细胞的影响［J］.中国药理学通报，2006，22(4):432 －436.

［6］ 吕晓东，张永祥，茹祥斌，等.山茱萸体液免疫抑制活性成分的药理学导向评价分离［J］.解放军药学学报，2002，18(6):357 －359.