糖基化反应改进肌原纤维蛋白质功能特性的研究进展

李文静，尚永彪,2,*，夏杨毅,2

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716)

糖基化反应改进肌原纤维蛋白质功能特性的研究进展

李文静1，尚永彪1,2,*，夏杨毅1,2

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716)

肌原纤维蛋白是肌肉中具有重要功能性质的一类蛋白质，肌原纤维蛋白的功能性质对食品的保水性、质构特性及感官品质具有重要的影响。糖基化反应是蛋白质改性的一种有效方法，具有一定的应用前景。文章综述肌原纤维蛋白与还原糖进行糖基化反应的机理与方法，糖基化反应对肌原纤维蛋白的溶解性、乳化性、热稳定性等特性的改善效果，并提出了今后的研究方向。

肌原纤维蛋白质；糖基化改性；功能特性

蛋白质改性就是用生化因素(如化学试剂、酶制剂等)或物理因素(如热、射线、机械振荡等)使蛋白质的氨基酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白大分子空间结构和理化性质的改变，从而获得较好功能特性和营养特性的蛋白质的技术[1]。蛋白质改性的方法有化学法和酶法，常用的化学改性方法有：酸碱或盐作用下的改性、磷酸化改性、酰基化改性、糖基化改性、脱酰胺改性等；常用的酶法改性方法有：蛋白酶水解、胃合蛋白反应、酶法蛋白质交联等[2-11]。

肌原纤维蛋白(myofibrillar proteins，MP)是一类具有重要生物学功能特性的盐溶性结构蛋白群，在肌肉蛋白质中占到55%左右，主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、肌动球蛋白、原肌球蛋白等。肌原纤维蛋白除在活体中参与肌肉的收缩、在胴体中影响肉的嫩度外，还与肉制品的功能特性，如流变学特性、保水性、乳化性等有密切关系，直接影响动物性食品的产量、质构、黏着力、保油性及保水性[12]。

肌原纤维蛋白可与各类还原糖发生糖基化反应，新生成的蛋白质在功能特性上会发生一定的变化。目前，国内外对于肌原纤维蛋白的糖基化研究还处于起步阶段，研究的对象也主要是鱼肉肌原纤维蛋白。研究表明，糖基化反应可使蛋白质的乳化性、溶解性、热稳定性等功能特性得到改善。而营养学和毒理学方面研究表明，通过糖基化的作用，鱼肉蛋白的过敏反应特性在一定程度上得到抑制。因为糖基化反应利用赖氨酸，所以赖氨酸有少量损失，但对其他氨基酸基本没有影响。由此看来，肌原纤维蛋白的糖基化具有重要的理论意义，在实践上也具有一定的应用前景。本文对糖基化反应改进肌原纤维蛋白质功能特性的研究进展进行综述，旨在为今后的相关研究提供参考。

1 糖基化反应机理与方法

1.1 反应机理

糖基化作用(glycosylation)就是将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上的α-或ε-氨基相连接而形成糖基化蛋白的化学反应[13]，反应分为初始阶段、中间阶段和最后阶段共三个阶段[14-15]，其原理与美拉德反应相同(图 1)。

图1 美拉德反应线路图[16]Fig.1 Maillard reaction route map

1.1.1 初始阶段

在pH4～9时，糖类的羰基和蛋白质的氨基可发生反应缩合成羰胺化合物，然后产物脱去一分子水生成希夫碱(Schiff base)，再经环化形成相应的N-取代醛糖基胺，N-取代醛糖基胺在酸的催化下经Amadori和Heyns重排形成Amadori或Heyns化合物。

1.1.2 中间阶段

当pH＜7时，Amadori重排产物主要进行1,2-烯醇化反应，脱水、脱氨最后生成羟甲基糠醛(hydroxyl methyl furfural，HMF)；当pH≥7时存在两个反应：一是发生2,3-烯醇化形成还原酮(reductones)和二羰基化合物，还原酮类化学性质活泼，可进一步脱水再与胺类缩合，或者本身发生裂解成较小分子如二乙酰、乙酸、丙酮醛等；二是继续裂解反应生成含羰基或双羰基化合物以进行最后阶段反应，或在二羰基化合物的存在下与氨基酸发生脱羧、脱氨作用，成为少一个碳的醛，氨基转移到二羰基化合物上，这一反应为Strecker降解反应。这一反应生成的羰氨类化合物经过缩合，生成吡嗪类物质。

1.1.3 最后阶段

此阶段反应相当复杂、其反应机制尚不清楚，主要是中间阶段产物与氨基化合物进行醛基-氨基反应最终形成糖化聚合体-糖基化蛋白(glycosylated protein)。

1.2 反应方法

1.2.1 肌原纤维蛋白的提取

不同的肌原纤维蛋白其提取方法有所不同。鱼肉肌原纤维蛋白的提取方法可根据Saeki[17]的方法进行：取鱼肉的白色肌肉组织，切碎后在3倍于肌肉体积的50mmol/L NaCl、质量分数为0.5%的Triton X-100溶液中漂洗10min，倾去悬浮物。将漂洗后的碎肉浸在8倍肌肉体积的50mmol/L NaCl、质量分数0.5% Triton X-100溶液中，用高速组织捣碎机12000r/min匀浆2min，用棉纱布过滤除去结缔组织，8000r/min冷冻离心10min，取沉淀物，再经50mmol/L NaCl溶液漂洗，8000r/min冷冻离心10min，反复进行4次，获得较纯的肌原纤维蛋白。所有操作均在8℃以下进行。

1.2.2 肌原纤维糖蛋白的制备

肌原纤维蛋白制备的一般流程：先将肌原纤维溶解，按比例加入还原糖混合，经过冷冻干燥，称取一定量的冻干粉混合物在一定的条件下进行糖基化反应。

鱼类肌原纤维糖蛋白的制备方法[18]：将肌原纤维蛋白分散在50mmol/L NaCl溶液中，使其最终质量浓度为6mg/mL，加入还原糖，进行冷冻干燥，－60℃冷冻干燥24h，冻干粉在－20℃冻藏。称取一定量的冻干粉混合物进行糖基化反应，糖基化反应在一定的温度、相对湿度和时间下进行。

糖基化反应时，常用的糖基供体主要有葡萄糖、葡聚糖、海藻低聚糖、乳糖、低聚异麦芽糖等[16]。不同的糖基供体对反应的条件要求也会有所不同，对肌原纤维蛋白各功能性质的改善效果也会有差异。葡萄糖和海藻低聚糖通过糖基化反应可以提高肌原纤维蛋白在低离子强度溶液中的溶解性和乳化性。葡聚糖可以改善肌原纤维的乳化性。

每一种糖基供体与肌原纤维蛋白进行糖基化反应时，都有最佳的质量比例，一般情况下糖比例越高，反应进行得越快，糖比例的变化对肌原纤维蛋白的溶解性、乳化性和热稳定性等功能特性的改善效果也有影响。随着糖基化反应进行的程度不同，其功能特性提高的程度也会有差异。

2 糖基化反应对肌原纤维蛋白功能性质的改进效果

肌原纤维蛋白由多种蛋白质组成，其中主要是肌球蛋白(相对分子质量约为50万～60万)和肌动蛋白(相对分子质量约为4.2万)。肌原纤维有良好的凝胶、保水等功能特性。但是当肌原纤维蛋白在应用中发生变性时，其功能特性也很快降低。通过糖基化反应，使肌原纤维与糖类结合生成新的糖蛋白。新合成的糖蛋白在溶解性、乳化性、热稳定性等功能特性方面都有不同程度的提高。

2.1 溶解性

Katayama等[19-20]用鱼肉肌原纤维蛋白质与葡萄糖以质量比1:18混合，经过冷冻干燥后在温度50℃、相对湿度5%～95%条件下进行糖基化反应。结果表明，相对湿度5%和35%时的反应产物在0.1mol/L NaCl溶液中的溶解性可显著提高，接近未糖基化的蛋白在0.5mol/L NaCl溶液中溶解性。但相对湿度65%时的反应产物在0.1mol/L NaCl溶液中的溶解性会减弱，相对湿度达到95%时其溶解性几乎丧失。因此，糖基化反应可改变肌原纤维在低离子强度下的溶解性，且相对湿度和葡萄糖浓度是影响肌球蛋白热变性的重要因素。实验还证明，糖基化改善肌原纤维的溶解性是因为肌球蛋白的成丝能力随着糖基化反应的进行而减弱，从而使其水溶性增加。

Saeki等[17,21]和Manabu等[22]对鲤鱼的肌原纤维蛋白进行了糖基化改性研究。以质量比1:9混合鲤鱼的肌原纤维蛋白与葡萄糖，经过冷冻干燥后，在温度40℃(0～24h)、50℃(0～12h)、60℃(0～6h)，相对湿度 65% 的条件下反应。结果表明，糖基化后肌原纤维蛋白在低离子强度溶液中的溶解性有显著提高，40℃糖基化反应进行12h后，在0.1mol/L NaCl溶液中，糖基化蛋白质的溶解性最高可达到63%，而未经糖基化的蛋白质在同样的溶液中溶解度只能达到11%。Sato等[23-24]以海藻多糖(alginate oligosaccharide，AO)为糖基供体对鲤鱼肌原纤维蛋白的功能特性进行改善，鲤鱼肌原纤维蛋白与海藻多糖按一定比例混合，经过冷冻干燥后，在温度40℃，相对湿度65%的条件下反应。结果表明，鲤鱼肌原纤维海藻多糖蛋白在低离子强度溶液中溶解性有很大提高，溶解性随着反应时间的延长逐渐提高，并且生成的糖蛋白在80℃加热2h溶解度也几乎没有改变。此外，糖蛋白中的赖氨酸含量没有明显减少。

Hirofumi等[25]将糖基化技术运用到冰冻大马哈鱼鱼肉蛋白功能特性的改进研究上，将大马哈鱼鱼肉蛋白与海藻多糖混合，一定条件下冻干后，在温度60℃和相对湿度5%～95%的条件下反应。结果表明，大马哈鱼鱼肉蛋白通过糖基化改性后其溶解性显著增强。

Katayama等[26-27]进一步研究发现鱼肉蛋白质与还原糖发生糖基化反应，该反应抑制了肌动蛋白形成肌原纤维纤丝的能力，从而提高其在低离子强度下的溶解性。研究还发现鲤鱼和贝类肌肉蛋白质在糖基化反应中分别有效利用了赖氨酸。鲤鱼肌原纤维蛋白与还原糖发生糖基化反应时，当糖蛋白中赖氨酸含量为69%，肌动蛋白的等电点从4.98降到4.17时，糖蛋白溶解度可达到97%；贝类肌原纤维蛋白经糖基化改性后生成的糖蛋白赖氨酸含量为73%时，肌动蛋白的等电点从5.03降到4.29，其溶解度达到83%。

国内学者对鲢鱼肌原纤维蛋白进行了糖基化改善研究。芦晶等[28]研究了鲢鱼肌原纤维蛋白与乳糖糖基化反应条件(乳糖与肌原纤维蛋白质量比、温度、反应时间)对肌原纤维乳糖蛋白溶解性的影响。结果表明，通过糖基化反应改善了鲢鱼肌原纤维蛋白的溶解性，温度和反应时间对肌原纤维蛋白溶解性的影响比乳糖与肌原纤维蛋白质量比对其的影响大。改善溶解性的最优条件是乳糖与鲢鱼肌原纤维质量比为1.5:1，温度50℃，反应时间18.5h。

尤娟等[29]分别以质量比4:1、2:1、1:1、1:2将低聚异麦芽糖与鲢鱼肌原纤维蛋白混合，经过冷冻干燥后，在温度55℃、相对湿度79%的条件下进行糖基化反应，结果表明：低聚麦芽糖对改善鲢鱼肌原纤维蛋白溶解性的作用不显著，当低聚麦芽糖与鲢鱼蛋白的混合质量比为4:1时，制备的糖蛋白的溶解性最高，在0.1mol/L NaCl溶液中溶解度为10%。

2.2 乳化性

Saeki等[17,21]对糖基化鲤鱼肌原纤维蛋白与鲤鱼肌原纤维蛋白的乳化特性进行比较，鲤鱼的肌原纤维蛋白在乳化后其乳化混浊度很快就会下降，在8min内就出现明显的油层，而糖基化鲤鱼肌原纤维蛋白乳化后在60min时仍保持较高的混浊度，且没有油层出现。鲤鱼肌原纤维蛋白的乳化稳定性通过糖基化反应可提高2～4倍。Sato等[23-24]研究发现，鲤鱼肌原纤维蛋白与海藻多糖发生糖基化反应，生成的糖蛋白的乳化性得到提高，即使在接近等电点时仍然保持较高的乳化性。

芦晶等[28]用乳糖改善鲢鱼肌原纤维的乳化活性，改性后的鲢鱼肌原纤维蛋白乳化活性有了很大的提高，实验得出最优条件是乳糖与鲢鱼肌原纤维蛋白质量比为2.15:1，温度50℃，反应时间18.5h。尤娟等[29]研究发现鲢鱼肌原纤维的乳化活性比较低，但乳化稳定性较好，经糖基化反应后乳化活性得到显著提高。反应产物的乳化性受糖与蛋白的比例的影响较小。

Fujiwara等[30]将葡聚糖与鲤鱼肌原纤维蛋白以质量比9:1混合，经冷冻干燥后，在40、50℃，相对湿度65%的条件下发生糖基化反应，改性后的鲤鱼肌原纤维蛋白乳化性得到很大提高，且其乳化特性在经过50℃热处理后仍未被破坏。

2.3 热稳定性

鲢鱼肌原纤维蛋白的热稳定性比较好，糖基化反应使蛋白的热稳定性进一步提高。芦晶等[28]研究了鲢鱼肌原纤维蛋白与乳糖糖基化产物的热稳定性，结果表明，生成的糖蛋白在经过热处理后，热稳定性(热处理前后未变性蛋白质的质量比)仍可达到75%。改善鲢鱼肌原纤维蛋白热稳定性的最优条件是乳糖与肌原纤维蛋白质量比为1.5:1、温度55℃、反应时间13h。尤娟等[29]对鲢鱼肌原纤维蛋白与低聚异麦芽糖反应生成的糖蛋白的热稳定性进行了研究，结果表明，生成的糖蛋白在经过热处理后，其热稳定性可达到95%以上。

Fujiwara等[30]对鲤鱼肌原纤维与葡聚糖发生糖基化反应产物的热稳定性进行了研究，结果表明，生成的糖蛋白热稳定性有很大提高，其乳状液的热稳定性在经过50℃热处理后，其性能仍未改变。

3 结 语

前人的研究表明，经过糖基化反应改性后，鱼肉肌原纤维蛋白在低离子强度溶液中的溶解性、乳化性及热稳定性等功能性质有大幅度的提高，可以用来改善动物性食品的品质；糖基化反应过程很复杂，反应条件也对肌原纤维蛋白质各功能特性的改善效果产生影响，故在对肌原纤维进行糖基化改性时，应根据加工需要选择适宜的反应条件。

糖基化反应是改变肌原纤维蛋白性质的一种有效方法，具有一定的应用价值。但是，由于肌原纤维蛋白的糖基化研究还处于起步阶段，此方法的理论研究与肉类产品生产中的实际应用还有相当的距离。如何合理选择糖基供体及确定糖基化反应条件，提高改性后的肌原纤维蛋白的应用价值，如何将改进技术应用于肉制品的加工生产等问题将是今后需要研究的主要方向。

[1] 李丹, 崔凯. 食品蛋白质的改性技术[J]. 食品与发酵工业, 1999, 25(6): 58-62.

[2] 莫文敏, 曾庆孝. 蛋白质改性研究进展[J]. 食品科学, 2000, 21(6): 6-10.

[3] MDINA L, COLAS M, MESTLE L E, et al. Physicochemical and dynamic properties of caseins modified by chemical phosphorylation[J].Food Sci, 2006, 57(3): 617-621.

[4] GUENTER M, JOHN R W. Chemical phosphorylation of food proteins:an overview and a prospectus[J]. Agric Food Chem, 1984, 32(4): 699-705.

[5] WANASUNDARA P K J P D, SHAHIDI F. Removal of flaxseed mucilage by chemical and enzymatic treatments[J]. Agric Food Chem, 1997,59(1): 47-55.

[6] GRUENER L, ISMOND M A H. Effects of acetylation and succinylation on the functional properties of the canola 12S globulin[J]. Food Chem,1997, 60(4): 513-520.

[7] AKIO K, ATSUSHI T, NAOTOSHI M, et al. Deamidation of food proteins by protease in alkaline pH[J]. Food Chem, 1987, 35(2): 224-227.

[8] FENNEMA O R. 食品化学[M]. 王璋, 许时婴, 江波, 等, 译. 北京: 中国轻工业出版社, 1991: 279-300.

[9] MICHIKO Y, SOICHI A, YUKIHIKO I, et al. A one-step process for incorporation of L-methionine into soy protein by treatment with papain[J]. Agric Food Chem, 1979, 27(1): 52-56.

[10] 张雅丽. 蛋白质酶法修饰的初步探讨[J]. 食品与发酵工业, 1994(2): 8-13.

[11] DAMODARAN S, PARAF A. Food proteins and their applications[M].New York: Marcel Dekker, 1997: 393-424.

[12] 夏秀芳, 孔保华, 张宏伟. 肌原纤维蛋白凝胶形成机理及影响因素的研究进展[J]. 食品科学, 2009, 30(9): 264-268.

[13] 罗永康, 张爱荣. 糖基化反应改善蛋白质功能特性的研究进展[J]. 食品科技, 2004(7): 4-6.

[14] 龚平, 阚健全. 美拉德反应产物性质的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(4): 141-146.

[15] 王延平, 赵谋名, 彭志英, 等. 美拉德反应产物研究进展[J]. 食品科学, 1999, 20(1): 15-19.

[16] 龚巧玲, 张建友, 刘书来, 等. 食品中的美拉德反应及其影响[J]. 食品工业科技, 2009, 30(2): 330-334.

[17] SAEKI H. Preparation of neoglycoprotein from carp myofibrillar protein by maillard reaction with glucose: biochemical properties and emulsifying properties[J]. Agric Food Chem, 1997, 45(3): 680-684.

[18] 张爱荣, 沈彗星. 鲢鱼肉肌原纤维乳糖蛋白的制备及其溶解性[J]. 中国农业大学学报, 2005, 10(3): 95-98.

[19] KATAYAMA S, SAEKI H. Cooperative effect of relative humidityand glucose concentration on improved solubility of shellfishmuscle protein by the maillard reaction[J]. Fisheries Science, 2004, 70(1): 159-166.

[20] KATAYAMA S, SAEKI H. Water solubilization of glycated carp and scallop myosin rods, and their soluble state under physiological conditions[J]. Fisheries Science, 2007, 73(2): 446-452.

[21] SAEKI H, INOUE K. Improved solubility of carp myofibrillar proteins in low ionic strength medium by glycosylation[J]. Agric Food Chem,1997, 45(9): 3419-3422.

[22] MANABU T, SAEKI H. Effect of maillard reaction with glucose and ribose on solubility at low ionic strength and filament-forming ability of fish myosin[J]. Agric Food Chem, 2001, 49(7): 3403-3407.

[23] SATO R, SEWAGE T, KASHIMIR H, et a1. Preparation of neoglycoprotein from carp myofibrillar protein and alginate oligosaccharide: improved solubility in low ionicstrength medium[J].Agric Food Chem, 2000, 48(1): 17-21.

[24] SATO R, KATAYAMA S, SAWABE T, et al. Stability and emulsionforming ability of water-soluble fish myofibrillar protein prepared by conjugation with alginate oligosaccharide[J]. Agric Food Chem, 2003,51(15): 4376-4381.

[25] HIROFUMI T, TOSHIYUKU I, AKIRA O, et a1. Feasibility study on water solubilization of spawned out salmon meat by conjugation with alginate oligosaccharide[J]. Fisheries Science, 2007, 73(4): 924-930.

[26] KATAYAMA S, SHIMA J, SAEKI H. Solubility improvement of shellfish muscle proteins by reaction with glucose and its soluble state in lowionic-strength medium[J]. Agric Food Chem, 2002, 50(15): 4327-4332.

[27] KATAYAMA S, HAGA Y, SAEKI H. Loss of filament-forming ability of myosin by non- enzymatic glycosylation and its molecular mechanism[J]. FEBS Letters, 2004, 575(1/3): 9-13.

[28] 芦晶, 沈慧星, 罗永康, 等. 糖基化反应改善鲢鱼鱼肉肌原纤维蛋白功能特性[J]. 中国农业大学学报, 2007, 12(4): 19-24.

[29] 尤娟, 张佳, 罗永康. 鲢鱼肌原纤维蛋白-低聚异麦芽糖的制备及功能特性评价[J]. 肉类研究, 2009, 23(9): 14-18.

[30] FUJIWARA K, OOSAWA T. Improved thermal stability and emulsifying properties of carp myofibrillar proteins by conjugation with dextran[J]. Agric Food Chem, 1998, 46(4): 1257-1261.

Research Progress in Functional Property Improvement of Myofibrillar Proteins by Glycosylation

LI Wen-jing1，SHANG Yong-biao1,2,*，XIA Yang-yi1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

Myofibrillar proteins are a kind of proteins, which reveal an important effect on water-holding capacity, texture properties and sensor quality of foods due to the functional properties of myofibrillar proteins. Glycosylation is an effective method to modify proteins, which have a wide range of application prospects. In this paper, the mechanisms and methods of glycosylation reaction between myofibrillar proteins and reducing sugars, and enhanced effect of glycosylation on solubility,emulsion and thermal stability have been reviewed. The future research directions have also proposed.

myofibrillar protein；glycosylation modification；functional property

TS251.1

A

1002-6630(2011)05-0306-04

2010-07-04

重庆市科技攻关项目(CSTC2010AC1008)；西南大学博士基金项目(SWU110008)；

重庆市特色食品工程技术研究中心项目

李文静(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mail：lwj-18@163.com

*通信作者：尚永彪(1964—)，男，副教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：shangyb@sohu.com