油菜蜂花粉蛋白的分离提取及其抗氧化活性*

邓建军，杨海霞，曹炜，程妮，王毕妮，高慧

1(西北大学食品科学与工程系，陕西西安，710069)2(西安交通大学医学院公共卫生系营养与食品卫生学学科，陕西西安，710061)

油菜蜂花粉蛋白的分离提取及其抗氧化活性*

邓建军1，杨海霞2，曹炜1，程妮1，王毕妮1，高慧1

1(西北大学食品科学与工程系，陕西西安，710069)2(西安交通大学医学院公共卫生系营养与食品卫生学学科，陕西西安，710061)

以油菜蜂花粉为研究对象，根据溶解性的不同，从中分离出了水溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白及盐溶性蛋白，并对各蛋白组分抗氧化活性进行了研究。结果表明:油菜蜂花粉中主要蛋白为水溶性蛋白，占其干重的7.35%，其次为醇溶性蛋白3.65%，盐溶性蛋白和碱溶性蛋白分别占2.50%和2.24%。4种不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白均具有一定的体外抗氧化作用，各蛋白组分的总抗氧化能力以及对DPPH自由基、OH·和·的清除能力呈现较好的量效关系;4种蛋白抗氧化活性由强到弱的顺序依次为水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞碱溶性蛋白＞盐溶性蛋白。因此，油菜蜂花粉蛋白质可作为一种潜在的天然抗氧剂进行深入研究。

油菜，蜂花粉，蛋白质，提取分离，抗氧化活性

蜂花粉是蜜蜂在采集花粉的过程中，加入一些花蜜和唾液，使其黏集成团，经过一系列的生物化学变化而形成的易于吸收的花粉团。蜂花粉是目前国际公认的天然营养保健食品之一［1－2］。

蜂花粉中含有丰富的营养成分，如必需氨基酸、蛋白质、不饱和脂肪酸、多糖、维生素和微量元素，还含有对人体生理机能有特殊功效的黄酮类、核酸、天然植物激素、性激素和促性腺激素等多种生物活性物质［1－2］。除此之外，蜂花粉中还含有 100多种酶，如过氧化物酶、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等［3］。研究表明，蜂花粉具有增强人体免疫功能、延缓衰老、改善消化道功能、抗疲劳、抑制前列腺增生和治疗便秘等许多生理功能［4］，其中绝大多数功能与蜂花粉的抗氧化作用有着密切的关系。关于蜂花粉抗氧化作用的研究一直是该领域研究的焦点，国内外许多学者认为正是由于蜂花粉含有大量的多酚以及黄酮类物质，才使得蜂花粉具有了很强的抗氧化活性［5－6］。本文以油菜蜂花粉为材料，采用不同溶剂对其蛋白质进行分离提取，同时对各种蛋白质组分的抗氧化活性进行测定，以期为扩大蜂花粉产品的深加工以及揭示蜂花粉抗氧化作用机理提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

油菜蜂花粉，由陕西老峰农生物有限责任公司提供;牛血清蛋白(美国Amresco公司，纯度≥99%的分析纯);硫代巴比妥酸(TBA)、D-脱氧核糖、考马斯亮蓝R-250、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、N，N-二苯基三硝基苯肼(DPPH)、氯化硝基四唑蓝(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)和还原型辅酶 I(NADH)，均为 Sigma-Aldrich Co.产品;其余试剂均为国产分析纯。

HH-2数显恒温水浴锅(常州国华仪器有限公司)，DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器(上海一基实业有限公司)，FD-1冷冻干燥机(北京博医康技术公司)，QG超纯水制备仪(美国Millipore公司)，超滤装置(美国Millipore公司)，KQ-100B恒温超声波清洗机(上海实验仪器厂有限公司)，飞鸽牌LXJ-IIB离心机(上海安亭科学仪器厂)，KDY-9830自动凯氏定氮仪(KETUO公司)，UV751GD紫外可见分光光度计(苏州江东精密仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 花粉的破壁

采用温差破壁法，参考胡筱波等［7］方法。将花粉除去泥沙、蜂足和草枝等杂物，然后研磨，置于－20℃以下冷冻约24 h，取出并迅速加入90～95℃热水中(比例为3 g∶1 mL)搅拌约10 min，然后迅速冷却到40℃左右保持6～8 h，冷冻干燥得破壁花粉，4℃贮藏待用。

1.2.2 油菜蜂花粉粗蛋白的分离、提取及含量的测定

1.2.2.1 水溶性粗蛋白的制备

在20 g破壁冻干的油菜蜂花粉样品中，加入400mL的去离子水，4℃下搅拌提取8 h，抽滤，用少量的蒸馏水分3次洗涤残渣，抽滤至干，滤液添加(NH4)2SO4至80%的饱和度，4℃静置12 h，4 800 g离心30 min，弃上清液，沉淀用50 mmol/L PBS(pH 7.4)缓冲液溶解，然后用截留分子质量为3 000 u的超滤膜进行超滤，重复3次，所得蛋白溶液真空冷冻干燥，－20℃保存待用。

1.2.2.2 盐溶性粗蛋白的制备

在上述水溶液提取的残渣中，加入400 mL 0.5 mol/L NaCl溶液，4℃下搅拌提取8 h。接下来的步骤除了(NH4)2SO4为40%以及沉淀溶解在0.5 mol/L NaCl溶液之外，其余均与1.2.2.1相同。

1.2.2.3 醇溶性粗蛋白的制备

在上述NaCl溶液提取的残留物中，加入200 mL体积分数75%乙醇，4℃下搅拌提取8 h，将其提取液抽滤至干。滤液中加入400 mL的去离子水，4℃静置12 h，4 800 g离心30 min。沉淀用体积分数75%乙醇溶解后，4℃下用去离子水透析24 h后，进行冷冻干燥，－20℃保存待用。1.2.2.4 碱溶性粗蛋白的制备

在上述乙醇溶液提取的残渣中，加入400 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，4℃下搅拌提取8 h。接下来的步骤除了(NH4)2SO4为40%以及沉淀溶解在0.1 mol/L NaOH溶液之外，其余均与1.2.2.1相同。

1.2.2.5 蛋白质含量的测定

总蛋白含量采用凯氏定氮仪测定;各组分蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定［8］，以牛血清蛋白作为标准。

1.2.3 油菜蜂花粉粗蛋白抗氧化活性的测定

将油菜蜂花粉水溶性粗蛋白、盐溶性粗蛋白、醇溶性粗蛋白及碱溶性粗蛋白分别用去离子水、0.5 mol/L NaCl溶液、体积分数75%乙醇和0.1 mol/L NaCl溶液配制成不同浓度的蛋白溶液进行抗氧化活性比较分析。

1.2.3.1 铁还原抗氧化能力(FRAP)测定

参照 Benzie和 Strain 的方法［9］，略做修改。FRAP工作液包括:300 mmol/L醋酸缓冲液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ盐酸溶液(盐酸浓度为40 mmol/L)和20 mmol/L FeCl3种溶液按照 1∶1∶10 的体积比混合。此工作液现用现配，使用前在37℃水浴中保温。取4.5 mL FRAP工作液，加入不同浓度的样品溶液0.1 mL，再加入3.4 mL去离子水，混合均匀后置于37℃水浴中反应30 min，然后测定593 nm处的吸光值，吸光值越大表示样品抗氧化性越强，以提取试剂作为空白对照。结果以Fe2+当量表示(mmol Fe2+/100 g)。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照LeBlanc等人方法［10］，并作修改。将不同浓度的4种油菜蜂花粉蛋白样品0.5 mL加入到9.5 mL浓度为40 μg/mL DPPH无水甲醇溶液中，迅速混合均匀后避光静置30 min，然后测定517 nm处的吸光值，以不加样品为空白对照，按照以下公式计算DPPH自由基清除率:

其中:A样品和A对照分别表示样品和对照在517 nm处的吸光度)。

1.2.3.3 羟基自由基(OH·)清除能力的测定

采用D-脱氧核糖法［11］测定OH·清除能力。向10 mL的试管中依次加入0.4 mL pH 7.4的PBS缓冲液(50 mmol/L)、0.1 mL的样品溶液、0.1 mL Vc(2 mmol/L)、0.1 mL H2O2(12 mmol/L)、0.05 mL D-脱氧核糖(8 mg/L)、0.1 mL(1 mmol/L EDTA)、0.1 mL FeSO4(1 mmo/L)，然后用PBS缓冲溶加至2 mL，反应物置于37℃水浴中30 min，每5 min振荡一次，取出后迅速加入1 mL 10%TCA和1 mL 1%TBA，沸水水浴15 min，立即冷却，若有浑浊，离心取上清液，以PBS缓冲溶液为空白对照，在532 nm处测其吸光度，按照以下公式计算OH·清除率:

其中:A样品和A对照分别表示样品和对照在532 nm处的吸光度)。

1.2.3.4 超氧自由基(O2－·)清除能力的测定

采用NBT法［12］测定O2－·清除能力。将不同浓度的样品溶液加入到NBT反应液(包括0.1 mmol/L PMS、1 mmol/L NADH和1 mmol/L NBT溶解于0.1 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液中)中，室温下［(25±1)℃］反应5 min，以PBS缓冲溶液为空白对照，在560 nm处测其吸光度，按照以下公式计算O2－·清除率:

其中:A样品和A对照分别表示样品和对照在560 nm处的吸光度)。

1.2.4 统计分析

采用Microcal Origin7.5软件(Microcal Softwere，Inc.，USA)进行数据处理、作图，采用SPSS10.0软件(SPSS Inc，USA)进行数据分析，差异性采用Turkey法进行多重比较，置信水平95%(P=0.05)，所有试验至少重复3次。

2 结果与分析

2.1 四种溶剂对油菜蜂花粉蛋白提取效果的影响

对油菜蜂花粉蛋白采用不同溶剂进行逐级分离提取，得到的各组分蛋白质含量图1所示(图1中不同字母表示样品之间有显著性差异)。结果显示，溶剂不同所得到的蛋白质含量也明显不同，其中水溶性蛋白是含量最高，约占花粉干重的7.4%，与其他3种蛋白在含量上存在显著性差异，分别是醇溶性蛋白的2.0倍、盐溶性蛋白的2.9倍及碱溶性蛋白的3.3倍。4种可溶性蛋白占油菜花粉干重的15.7%，占总蛋白含量的64%(凯氏定氮法测得总蛋白含量为24.6%)。

图1 四种溶剂对油菜蜂花粉蛋白提取效果的影响

2.2 油菜蜂花粉蛋白的铁还原抗氧化能力比较分析

FRAP法具有操作简单以及结果重复性好等特点，被广泛应用于许多食品成分总抗氧化能力的分析中［9］。对不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白总抗氧化活性采用FRAP法测定结果表明，4种蛋白均具有不同程度的铁离子还原能力，且随着蛋白浓度的增加，FRAP值也逐渐增大(如图2所示)。其中水溶性蛋白铁离子还原能力最强，其次为醇溶性、碱溶性，盐溶性最小，例如，当蛋白质浓度为0.8 mg/mL时，水溶性蛋白FRAP值为2.54 mmol Fe2+/100g，分别是醇溶性蛋白的1.7倍、碱溶性蛋白的4.0倍及盐溶性蛋白的6.4倍。FRAP值越大说明反应体系中抗氧化剂的抗氧化能力越强，由此可知，油菜蜂花粉蛋白中存在有未知的抗氧化活性蛋白，且水溶性蛋白中抗氧化蛋白含量最高，与蛋白的抗氧化能力表现出了良好的正相关。由于蛋白在提取过程中采用3 000的超滤膜进行了处理，各蛋白组分所表现出的抗氧化活性排出了多酚类物质以及小分子抗氧化活性肽的可能性。该试验结果初步说明从油菜蜂花粉中提取天然的抗氧化活性蛋白是可行的。有待于从自由基清除力的角度进一步研究各蛋白组分抗氧化活性。

图2 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白的铁还原抗氧化能力比较

2.3 油菜蜂花粉蛋白对DPPH自由基的清除能力

DPPH作为一种非常稳定的质子自由基，当体系中存在抗氧化物质时由于单电子配对使其吸收减少，故可通过测定DPPH自由基含量的变化可评价抗氧化物质的抗氧化能力，目前已经被普遍使用［13］。本研究对四种不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白的DPPH自由基清除能力的测定结果如图3所示。在0.2～1.0 mg/mL内，4种粗蛋白均具有不同程度清除DPPH自由基的能力，随着浓度的增加，各种蛋白组分DPPH自由基清除能力也逐渐增强，呈剂量依赖性关系;相同质量浓度下，4种蛋白组分的DPPH自由基清除率的顺序依次为水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞碱溶性蛋白＞盐溶性蛋白。例如，在蛋白浓度为1 mg/mL时，水溶性蛋白的DPPH清除率达69.8%，比醇溶性、碱溶性及盐溶性蛋白的清除率分别高出为17.5%、25.5%和28.6%。

图3 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白对DPPH自由基的清除能力

2.4 油菜蜂花粉蛋白对OH·的清除能力

OH·是一种普遍存在于机体的活性氧自由基，反应活性极强，许多物理、化学因子损伤都会促进其形成，是造成机体过氧化损伤的主要诱发因子［14］，因此，寻找天然的清除OH·的抗氧化剂非常有必要。试验中采用D-脱氧核糖法比较不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白对OH·的清除能力，结果表明，各蛋白组分均具有不同程度的清除OH·的能力，且清除率随着样品浓度的增加而增大，表现出良好的量效关系(如图4所示)。当蛋白浓度≤0.4 mg/mL时，醇溶性与碱溶性蛋白对OH·的清除率相当，水溶性蛋白对OH·的清除率远高于其他3种蛋白;当蛋白浓度＞0.4 mg/mL时，4种蛋白对OH·的清除率表现出明显的差异，相同质量浓度下，4种蛋白组分对OH·的清除率与对DPPH自由基清除率的顺序一致，即:水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞碱溶性蛋白＞盐溶性蛋白。例如，蛋白浓度为1 mg/mL时，水溶性、醇溶性、碱溶性及盐溶性蛋白对OH·的清除率分别为75.8%、55.3%、46.3%和35.2%。

图4 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白对OH·的清除能力

3 结论与展望

采用不同溶剂对油菜蜂花粉蛋白进行分离提取，发现水溶性蛋白是油菜蜂花粉蛋白质的主要组分，约占花粉干重的7.35%，醇溶性蛋白次之，盐溶性蛋白和碱溶性蛋白含量最少。通过对不同溶解性的油菜蜂花粉蛋白抗氧化活性测定，发现4种蛋白均具有铁离子还原能力以及对DPPH自由基、OH·和O－2·也具有较强的清除能力，且与蛋白质浓度呈现良好的量效关系。四种蛋白抗氧化活性顺序依次为:水溶性蛋白＞醇溶性蛋白＞碱溶性蛋白＞盐溶性蛋白。

目前，研究者普遍认为这些功能大多与蜂花粉中的黄酮、多酚及小分子活性肽的抗氧化作用有着密切的关系。而本研究发现油菜蜂花粉中的可溶性蛋白质也具有较好的抗氧化活性，尤其以水溶性蛋白质的抗氧化活性最强，因此，油菜蜂花粉蛋白可作为一种潜在的天然抗氧剂进行开发研究。同时，分离鉴定具有抗氧化功能的目标蛋白质并揭示其抗氧化机理也是非常值得我们去探究的新课题。

图5 不同溶解性油菜蜂花粉蛋白对·的清除能力

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Study on Extraction and Antioxidant Activity Analysis of Rape Bee Pollen Protein

Deng Jian-jun1，Yang Hai-xia2，Cao Wei1，Cheng Ni1，Wang Bi-ni1，Gao Hui1
1(Department of Food Science and Technology，Northwest University，Xi’an 710069，China)2(Department of Nutriology and Food Sanitation，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China)

In this paper，rape bee pollen was used as the research object.Four types of rape bee pollen protein，including water-soluble，ethanol-soluble，salt-soluble and alkali-soluble protein were extracted by their different dissolving abilities.The antioxidant activities were investigated.The results showed that the contents of water-soluble protein，ethanol-soluble protein，alkali－soluble protein and salt-soluble protein were 7.35%，3.65%，2.50%，and 2.24%，respectively.All four protein components from rape bee pollen had antioxidant activity.The relationship between concentration and the total antioxidant power，the scavenging power on DPPH，OHo，and O-2o all showed positive correlation with the concentration.Antioxidant activity from strong to weak was in the following order:water-soluble protein＞ethanol-soluble protein＞alkali-soluble protein＞salt-soluble protein.Therefore，rape bee pollen proteins have the potential as natural antioxidant.

rape，bee pollen，extraction，antioxidant activity

博士，讲师。

*西北大学校内基金(NG10002);西北大学科研启动金(PR10037)

2011－07－13，改回日期:2011，09－22