榆干离褶伞发酵液的溶栓与降血脂作用*

沈明花，彭 瀛，宋晓琳

(延边大学，吉林 延吉，133000)

我国食用菌种类很丰富，药食用菌接近2000余种，但在医药保健品方面的开发利用程度很低。食用菌不仅含有丰富的营养成分且其药理活性也非常广泛，具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、保肝、溶栓［1-5］等功能。目前在国内，有关食用菌活性成分及相关功能的深入研究比较少。

榆干离褶伞(Lyophyllum ulmarium，L．u)，又名大榆蘑。属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、离褶伞属。分布于我国河北、吉林、黑龙江、河南、甘肃、青海等省。实验证明，榆干离褶伞菌丝体含有分子量为50 ku的溶栓酶［6］。其发酵液具有抗氧化作用和保肝作用［7－8］。本课题以榆干离褶伞发酵液为研究对象，探讨其对机体的出凝血时间、血脂以及体外溶栓作用，为榆干离褶伞的开发利用提供实验依据。

1 材料与试剂

样品的制备:榆干离褶伞菌种由韩国益山大学特种作物加工实验室提供。在25℃，150r/min液体深层二级培养15d。将发酵液用纱布过滤，收集滤液以3 000r/min离心15 min后将上清液进行冷冻干燥，得样品。

实验动物:昆明种小鼠，18～22 g，雌雄各半。家兔，雄性。均由延边大学医学部动物科提供。

试剂:阿司匹林肠溶片:吉林华康药业股份有限公司产品;洛伐他汀胶囊:扬子江药业集团有限公司产品;总甘油三酯、总胆固醇试剂盒购于南京建成科技有限公司。

2 方法

2.1 L．u发酵液对血栓的体外溶解作用

采集兔子血置于试管中使其自然凝固。用滤纸吸干血栓表面，各切成0.5g小块。将血块放入试管中后分别加入50、100、200 mg/mL浓度的 L．u发酵液1mL，置于37℃恒温水浴。隔2、4和8h将血块取出，吸干称重，连续测定3次，计算其溶解率。以生理盐水作为空白对照组，阿司匹林作为阳性对照组。

2.2 L．u发酵液对体外凝血时间的影响

将兔子断头取血。取5支灭活小试管，分别加生理盐水、一定浓度的阿司匹林和3种不同浓度的L．u发酵液0.3 mL，然后在每管再加0.5 mL的血液。轻轻振荡混匀，置37℃恒温水浴，用玻片法测定凝血时间。每管设3个平行管。

2.3 L．u发酵液对小鼠凝血时间的影响

将50只小鼠随机分为5组，设正常组、阿司匹林组(5 mg/kg)、用药小、中、大剂量组(50、100、200 mg/kg)。每日灌胃给药1次，连续10d(正常组灌等量的生理盐水)。末次给药1h后，以弯头眼科镊迅速摘取眼球，将血滴于载玻片两端各1滴，每隔30s用大头针轻轻地挑动血滴1次，当有血丝被挑起时停止计时，记录凝血时间，此段时间为全血凝固时间，另l滴血供复验。

2.4 L．u发酵液对小鼠出血时间的影响

动物分组及处理同2.2。采用断尾法［9］测定小鼠出血时间。

2.5 L．u发酵液对高脂血症小鼠血脂的影响

将60只小鼠随机分为6组，设正常组、高脂模型组、阳性药洛伐他汀组、用药小、中、大剂量组(50、100、200 mg/kg)。每日灌胃给药1次，连续10 d(正常组和模型组灌等量的生理盐水)。于末次给药后2h，除正常组外，其余各组小鼠均腹腔注射75%新鲜蛋黄乳液(0.5mL/只)造成实验性高血脂症。造模后禁食20 h，摘除眼球取血，分离血清，测小鼠血清中TG、TC的含量。

2.6 测定方法

均按试剂盒说明书操作。

2.7 统计学处理

用SPSS统计软件处理。

3 结果

3.1 L．u发酵液对血栓的体外溶解作用

由图1可知，在同一时间段内阿司匹林和L．u发酵液的溶栓率高于生理盐水，说明它们具有一定的溶栓能力。在6h之前，L．u发酵液的溶栓能力大于阿司匹林;到8h时，高浓度L．u发酵液的溶栓能力与阿司匹林相似，中、低浓度L．u发酵液的效果低于阿司匹林。

3.2 L．u发酵液对体外凝血时间的影响

图2所示，不同浓度L．u发酵液作用以后的凝血时间长于阿司匹林组，尤其是中、高浓度组效果显著，与阿司匹林组有显著差异。

图1 L．u发酵液对血栓的体外溶解作用

图2 L．u发酵液对体外凝血时间的影响

3.3 L．u发酵液对小鼠出、凝血时间的影响

如表1所示，除小剂量L．u发酵液的凝血时间与正常组无显著差异以外，阳性对照组和各用药组与正常组相比，出血和凝血时间明显延长。对用药组而言，其凝血和出血时间随用药剂量的增加而延长。

表1 L．u发酵液对机体出、凝血时间的影响

3.4 L．u发酵液对小鼠血脂的影响

如表2所示，模型组总甘油三酯和总胆固醇含量显著高于正常组，说明高脂血症模型成功。阳性对照组和用药组显著降低血脂水平，与模型组相比有显著性差异。用药组用药剂量与血脂水平呈剂量依赖性。

表2 L．u发酵液对血脂的影响

4 讨论

本实验通过液态发酵技术，获得榆干离褶伞发酵液，对其进行了抗凝、溶栓和降脂方面的试验研究。因发酵液没有经过分离提取等纯化过程，有效成分的浓度相对低，所以做体外实验时用药浓度比较大。实验结果显示，L．u发酵液在体外具有溶栓作用并延长出、凝血时间，这就说明发酵液具有抗凝作用。这种抗凝作用有可能作为L．u发酵液的溶栓机制之一。对榆干离褶伞菌丝体中分离的溶栓酶进行特性分析时发现，该酶在体外可直接水解纤维蛋白和纤维蛋白原［10］。这2种结果显示，在液态发酵过程中，榆干离褶伞菌丝体有可能向培养液分泌一些溶栓酶。这种溶栓酶直接或间接地水解纤维蛋白或纤维蛋白原，从而抑制血液凝固和血小板的聚集，起到抗血栓或溶血栓的作用。

高脂血症是血粘度增高的主要原因，也是加速血栓形成的重要因素之一。血脂增加不仅可使血小板功能亢进，而且还抑制纤维蛋白溶解酶原活化素的生成，从而促进血栓的形成。另一方面，血脂增加或脂质异常都可引起血管内皮损伤，导致内皮脱落，组织因子释放，激活凝血系统，出现高凝状态［11］。实验中还探讨了L．u发酵液对血脂的影响。研究结果显示，发酵液降低血清总胆固醇和总甘油三酯水平，这就说明它可降低血液粘稠度，对血栓的形成有一定的预防作用。至于L．u发酵液是否具有体内溶栓作用，其具体活性成分及相关机制的研究有待进一步研究。

［1］ M Ye，Liu JK，Lu Z X，et al．A potential antitumor natural product from the mushroom Albatrellus confluens，inhibits tumor cell growth by inducing apoptosis in vitro［J］．FEBSLetters，2005，579:3437 －3443.

［2］ 林桂兰，许学书，连文思．食用菇多糖提取物体外抗氧化性能研究［J］．华东理工大学学报:自然科学版，2006，32(3):278 －281.

［3］ 侯玉如，吴京燕，江海涛，等．柳松菇对急性四氯化碳肝损伤的防护作用［J］．中国食用菌，2005，24(2):50 －53.

［4］ Hirofumi Maruyama，Tetsuro Ikekawa．Immunomodulation and antitumor activity of a mushroom product，proflamin，isolated from Flammulina velutipes(W．Curt．:Fr．)Singer(Agaricomycetideae)［J］．International Journal of Medicinal Mushrooms，2007，9(2):109 －122.

［5］ Park SE，Li MH，Kim JS，et al．Purification and characterization of a fibrinolytic protease from a culture supernatant of Flammulina velutipesm ycelia［J］．Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2007，71(9):2 214－2 222.

［6］ 沈明花，金在城，朴世恩，等．榆干离褶伞菌丝体中溶栓酶的分离纯化［J］．食品研究与开发，2007，28(8):41－43.

［7］ 孙权，沈玉秀，沈明花．榆干离褶伞发酵液体外抗氧化性能研究［J］．食品科技，2010，35(1):223－225.

［8］ 金梅花，沈玉秀，沈明花．榆干离褶伞发酵液对急性肝损伤的保护作用［J］．食品科技，2010，35(4):78 －80.

［9］ 蔺新英，郭冬梅，苏维娜，等．豆豉提取液抗凝血作用的实验研究［J］．中国老年学杂志，2006，26(8)1081－1082.

［10］ 沈明花，沈寿东，全吉淑，等．榆干离褶伞菌丝体溶栓酶特性研究［J］．食品科技，2008，33(3):57－59.

［11］ 张秋灵，孙萌．缺血性脑卒中患者血粘度和血脂关系探讨［J］．实用临床医药杂志，2009，13(6):80 －81.