不同营养方式对普通小球藻生长特性和细胞组成的影响*

曹云涛，孔维宝，，葸玉琴，李龙囡，夏春谷

1(西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州，730070)

2(中科院兰州化学物理研究所，羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州，730000)

小球藻属绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(Chlorolla)，是一类普生性单细胞藻类［1］。常见的有蛋白核小球藻(C．pyrenoidosa)、椭圆小球藻(C．ellipsoidea)、普通小球藻(C．vulgaris)等［2］。小球藻含丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、微量元素和活性代谢产物，具有降血压、降血脂，抗动脉粥样硬化，增强免疫力，抗肿瘤以及抗病毒感染等保健功能［3］。

小球藻除了可以利用光能和CO2进行光合自养以外还可以利用一种或多种有机物作为能源和碳源在黑暗中生长［4］，即进行异养繁殖，类似于细菌的发酵。除此之外，它还可以在光照条件下，利用有机碳源进行混合营养生长，而且生长速度和藻密度较高。由于小球藻的这一特性及其较高的应用价值，异养和混合营养方式成为微藻生物技术领域的研究热点［5］。目前，有关小球藻培养的研究国内外主要集中在自养和异养方面［6］，但是对自养、异养和混养三者之间的比较研究，特别是较为系统地研究微藻的混养特性的报道相对较少。本研究通过比较分析不同营养模式下小球藻的生长特性和细胞组成的变化，以期获得高密度培养小球藻的理想模式，为充分利用这一微藻资源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 藻种

普通小球藻(Chlorella vulgaris)，购自中科院水生生物研究所淡水藻种库。

1.1.2 试剂

NaHCO3、葡萄糖、正己烷和培养基营养盐等均为分析纯试剂。

1.1.3 SEM培养基

基础培养基为土壤浸出液培养基(g/L):0.250 NaNO3、0.075 K2HPO4· 3H2O、、0.075 MgSO4·7H2O、0.025 CaCl2·2H2O、0.175 KH2PO4、0.025 NaCl、0.005FeCl3· 6H2O，1.0 mL Fe-EDTA、A5 溶液(组分为:2.860 H3BO3、1.810 MnCl2·H2O、0.222 Zn-SO4·7H2O、0.079 CuSO4· 5H2O、0.390 Na2MoO4·2H2O):1.0 mL/L、土壤浸出液:40.0 mL/L。

1.2 仪器与设备

TDL－5000B低温冷冻离心机;LDZX－40B1型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安;电子天平，日本岛津;恒温光照摇床，江苏太仓;超净工作台，江苏苏净;日立UV－1800可见紫外分光光度计;酸度计，美国奥利龙;溶氧仪，上海雷磁;GY92－2D超声波细胞破碎仪，浙江宁波;旋转蒸发仪，河南巩义;电热烘箱，上海一恒。

1.3 实验方法

1.3.1 实验设计

实验分为自养、异养、混养3组，每组又根据不同碳源浓度设2个处理，3个平行。所有处理均在100 mL SEM培养基中接种10mL对数生长期藻液，各处理分别添加不同碳源和光照处理(见表1)。

表1 实验设计表

1.3.2 培养方法

调培养基pH至7.2后分装，121℃高压灭菌20 min(NaHCO3经紫外灭菌后添加于冷却培养基中以防分解和产生沉淀)。无菌条件下吸取对数生长期的藻液10 mL接入100 mL培养液中，摇匀后置于光照恒温摇床中培养，自养和混养组直接暴露于光下，异养组用双层黑塑料袋遮光处理。培养温度为(25±1)℃，摇床转速为120 r/min，光强度为2 500 Lux，光周期为12 L:12 D，培养6 d。

1.3.3 测定方法

1.3.3.1 藻密度测定方法

采用浊度比色法测定藻密度，每12 h从培养瓶中取一定量藻液适当稀释后测660 nm处吸光值，根据标准曲线［Y(g/L)=0.385 1×A660－0.017(R2=0.996 7)］计算质量浓度(g/L)。根据公式:μ=［(ln Xt－ln X0)/(t－t0)］×2.303(其中 X0、Xt分别为对数生长期始末的吸光值，t、t0为相对应的培养时间)求比生长速率;并根据培养时间、密度和体积等参数计算产率。

1.3.3.2 pH值的测定

pH采用酸度计测定。每48h于无菌条件下测定各处理培养液中的pH值。

1.3.3.3 葡萄糖含量的测定

残糖含量的测定采用蒽酮比色法［7］，根据标准曲线方程［Y(μg)=321.94 A620+0.804(R2=0.999 4)］计算葡萄糖含量。

1.3.3.4 光合色素含量的测定

采用三波长比色法［8］。

1.3.3.5 可溶性蛋白质含量的测定方法

采用考马斯亮蓝染色法［8］。培养结束后的藻液在4 000 r/min下离心10 min，用无菌水洗涤藻泥3次，用100 mmol/L NaCl溶液稀释藻泥，并进行细胞破碎(400 W，20 min，超声5 s，间歇1 s)，破碎液于4 000 r/min离心10 min后取上清测定可溶性蛋白质含量，根据标准曲线方程［Y(μg)=92.513 A595－0.7613(R2=0.9996)］计算可溶性蛋白质含量。

1.3.3.6 油脂含量的测定

采用正己烷提取-称重法。4 000 r/min离心10 min收集培养结束的藻液，蒸馏水洗涤2次，离心收集藻泥并于70℃烘干至恒重;将干藻体用小型研磨器充分研磨至细粉，用正己烷反复抽提5次，每次振荡提取1h，合并提取液，45℃旋转蒸发回收溶剂后在70℃烘干至恒重，称重计算油脂含量。

1.4 数据统计与分析

所有实验组均设置3个平行，所列数据采用Excel和SPSS13.0统计分析，均为3次平行测定的平均值，以平均值±标准偏差(Mean±Std)表示。表中同一行数据中不同字母代表在a=0.05水平上存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同营养方式对小球藻生长特性的影响

采用自养、异养和混合营养3种方式对小球藻进行培养，在相同条件下对其生长过程中的动态变化进行检测，结果见图1。

图1 不同培养方式对小球藻生长的影响

从图1可以看出，3种营养方式中，异养和混合营养的生长速率明显优于自养。而在异养和混养两者中，后者又表现出一定的优势，尤其是在生长的稳定期，异养方式因为能源物质消耗殆尽，进入衰退期，而混养却生长强劲，增长速度平稳。这是由于混合营养兼有自养和异养的特点，即在基质中葡萄糖消耗完以后小球藻可进行自养代谢，使得藻细胞继续生长［9］。

碳源是影响小球藻生长的重要因素。从图1中可以看出，对于每一种营养方式，较高浓度的碳源可以在一定程度上提高小球藻的生长速度和生物量的积累，而异养和混合营养在生长后期的差别也从另一个方面说明葡萄糖作为碳源对小球藻生长有促进作用，葡萄糖的存在可能弥补了气体碳源CO2供应的不充足，并可能使细胞在碳源利用中节省所消耗的ATP和NADPH［10－11］。光照作为另一个影响小球藻生长的因素，其重要性在本实验中也得到证实。另外在一个光暗培养周期中，光照条件下小球藻的生长也略快于黑暗条件下。这说明光能够促进碳源的代谢和能量的输送［12］，利于混合营养的进行。

由表2可以看出异养和混合营养的比生长速率明显高于自养，分别是其4.25～5.45倍和4.25～4.28倍，这也进一步说明了图1的结论。而从平均产率来看，混合营养优势更加明显，其产率为3种营养方式中最高，分别是自养、异养的5.79～6.27倍和1.11～1.31倍。因此，混合营养是获得小球藻高密度、高产量、短周期培养的最佳营养方式。

表2 不同营养方式对小球藻比生长速率及产率的影响

2.2 不同的营养方式下培养基的pH和葡萄糖含量变化

pH是影响藻类生长代谢的重要因子之一，培养基的pH值会影响光合作用中CO2的可用性，在呼吸作用中会影响微藻对有机碳源的利用效率，同时由于pH值直接影响细胞膜的渗透性，会影响微藻细胞对培养液中离子的吸收和利用，以及代谢产物的再利用性和毒性［13－14］。图2为不同营养方式下培养基中pH的变化情况。

图2 不同营养方式对小球藻培养基pH值的影响

可以看出自养条件下培养基中pH总体处于增长的趋势且一直保持在碱性范围。这是由于自养条件下小球藻光合作用强烈，随着细胞的增殖而不断消耗培养基中由 NaHCO3产生的 CO2，导致HCO3－解离。异养条件下pH表现为先降后升，但变化范围不大，这是因为小球藻在异养条件没有光能无法利用环境中的CO2，导致CO2积累，培养基酸性增加。而混合营养pH值介于自养和异养之间，并且有明显的升降变化，这表明混合营养条件下，细胞的光合作用和呼吸代谢强度存在相互竞争和补助，即呼吸代谢产生的CO2会被光合途径中的CO2泵回收重新利用。混合营养过程中培养基中pH的变化可能与葡萄糖代谢副产物的某些小分子有机酸有关［15］。另外，碳源浓度对pH的影响也可从图2中体现出来，异养和混养条件下较高浓度的碳源抑制了培养基中pH的上升，自养条件下则表现为促进作用。

图3为混合营养和异养条件下培养基中葡萄糖含量随培养时间的消耗情况。可以看出混合营养和异养对培养基中葡萄糖的消耗趋势大体相当。但是图3中也反映出混合营养和异养之间仍有轻微差异，这可能是因为混合营养有光合作用和呼吸作用产生的CO2回补效应，致使对葡萄糖的消耗不如异养强烈。

图3 培养过程中培养基中葡萄糖含量的变化

2.3 不同营养方式对小球藻光合色素含量的影响

图4为不同营养方式下小球藻叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量的变化。由图4可知，不同营养方式下自养方式积累的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素明显高于异养和混合营养方式;而异养和混合营养相比较，后者光合色素的含量较高。但是自养方式下小球藻的生物量很低，所以其光合色素总量很低。实验中还发现异养条件下的藻液呈淡黄色，这与小球藻在异养转化过程中出现叶绿素逐渐消失、细胞呈黄化的现象有关［16］，也有报道称小球藻的营养方式在从自养向异养转换过程中，细胞中叶黄素的含量会增加［17］。

图4(a)和图4(b)为不同营养方式对小球藻细胞中叶绿素a和叶绿素b的影响。可以看出异养和混合营养条件下单位质量小球藻细胞中叶绿素a和叶绿素b的含量均有所下降，其中异养下降的更为明显。而在这两种营养方式下，培养基中葡萄糖浓度越高叶绿素a、b含量反而越低，这表明葡萄糖不利于光合色素的合成，有机碳作为混养和异养的碳源可能对微藻的光合活性造成一系列影响［18］。因为光照的原因，自养和混合营养条件下叶绿素a和叶绿素b的含量随小球藻细胞的生长和细胞数目的增多而提高，其总量的积累也随之增多，而叶绿素a含量增加的更快;而在异养条件下，小球藻中叶绿素a、b的含量表现为下降，这是因为细胞不能在黑暗中合成叶绿素，随着细胞分裂的进行，单个细胞内的叶绿素含量越来越少［19］。图4(c)为不同营养方式下小球藻中总叶绿素含量的变化。由图看以看出，总叶绿素含量的变化趋势和图4(a)图4(b)的相同。

图4 不同营养方式对小球藻光光合色素含量的影响

由图4(d)可知，不同营养方式对单位质量小球藻中类胡萝卜素含量的影响也很明显，不同培养方式中以自养条件下类胡萝卜素的含量最高，混合营养次之。而在相同的培养方式条件下，碳源的浓度同样对小球藻中类胡萝卜素的含量也有影响，表现为高浓度葡萄糖轻微抑制类胡萝卜素的合成。

对不同营养方式下小球藻总叶绿素含量和产率分析见表3。可以看出，单位质量小球藻中总叶绿素的含量和产率都以自养为最高，但是由于自养方式下的细胞密度较低，故其总产量也较低，所以自养条件下单位体积藻液中所含总叶绿素较混合营养的低，而单位体积藻液中总叶绿素的产率以混合营养的最好。所以混合营养条件下随着细胞密度增大，叶绿素浓度也增加，叶绿素浓度与细胞密度变化大致存在相同的变化趋势。

2.4 不同营养方式对小球藻蛋白质含量的影响

表4中比较了不同营养方式下单位质量、单位体积蛋白质含量以及产率的差异。从表4可以看出，单位质量蛋白质含量以自养方式下为最高，达到43.28%，这与李师翁等的［20］研究结果相一致。但是因自养生物量低的缘故，所以单位体积含量则表现为最低;而混合营养方式因为其生物量大，细胞密度高，其单位体积蛋白质含量在不同营养方式中为最高，相应的其产率也为最高。细胞在生长的前期，主要是利用培养液中的营养物质进行分裂繁殖，增加生物量。当营养盐消耗将尽，生物量积累到一定程度后，细胞进人生长的平衡期，此时，开始大量分泌次级代谢产物，胞内蛋白质的合成与积累主要在此期间进行［21］。而混合营养方式因为自身的优点，能够在小球藻生物量增加以后仍提供营养支持，延长平衡期，以利于胞内蛋白的积累，所以混合营养同样也是高密度培养小球藻的前提下获得高蛋白含量的最佳营养方式。

表3 不同营养方式对小球藻叶绿素含量和产率的影响

表4 不同营养方式对小球藻蛋白质含量和产率的影响

2.5 不同营养方式对小球藻油脂含量的影响

表5为不同营养方式下小球藻油脂含量的比较，从表5中可以看出，对于3种营养方式在单位质量、单位体积和产率3个方面，混合营养条件下小球藻油脂积累量为最高，并且明显优于自养和异养方式。尤其是混合营养条件下，高浓度的碳源有利于油脂的积累，其油脂含量达到13%，产率也达到了44.65mg/(L·d)，这与有关报道相符合［22］。从其他2种营养方式中也可以看出，高浓度的碳源对小球藻细胞中油脂的积累有促进作用，这是因为碳源浓度的提高刺激了小球藻的生长，使得小球藻油脂积累进程加快，产率也得以提高。所以混合营养方式也是小球藻获得高油脂含量的最佳培养方式。据桂林等［23］报道，采用自养、异养和混合营养培养蛋白核小球藻时发现异养条件下粗脂肪含量最高，这和本实验有出入。这可能是由于藻种的不同或培养基不同的原因所致，因为小球藻油脂含量的高低同时还受基质pH、盐度、C/N、营养盐等因素的影响［24－26］。

表5 不同营养方式对小球藻油脂含量和产率的影响

3 讨论

本文比较研究了自养、异养、混合营养不同培养条件下，普通小球藻的生长特性和细胞组成，考察了不同营养方式下小球藻的比生长速率及产率、培养过程中培养基中pH和葡萄糖含量、光合色素含量、蛋白质含量、油脂含量等方面的差异。结果表明，混合营养培养是高密度，高生物活性物质培养小球藻的最佳方式。在混合营养培养条件下小球藻的比生长速率和产率为最大，单位体积所合成的光合色素含量高，并且其蛋白质和油脂产率也较自养和异养方式下的高。自养条件下单位质量的藻体可获得较高的光合色素和蛋白质含量，但其最大的缺点是生物量太低。虽然异养培养使小球藻生物量有了很大提高，但是异养型微藻的种类相对较少［4］。

目前小球藻大规模培养多使用开放式或封闭式池塘培养系统(即自养方式)，这种培养系统成本较低，但自养方式下生物量太低，油脂含量也不高，且易污染。异养培养小球藻为扩大其生产规模开辟了广阔的前景，但是目前报道的异养微藻的种类相对较少。研究表明，混合营养培养条件下小球藻的生物量、光合色素、蛋白质和油脂产率相对较高，所以混养方式为生产高密度、高品质微藻提供了一种理想模式，而且混合营养方式更加符合微藻生长的实际环境，可培养的微藻种类相对较多［27］，具有规模化生产的潜在应用价值。

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