乳酸脱氢酶在CTAB-戊醇反胶束体系中的催化动力学研究

柳畅先，胡亚楠，马 璐

(中南民族大学 化学与材料科学学院,武汉 430074)

反胶束体系是一种类生命环境介质，广泛应用于生物物质活性控制方面[1]，它作为酶反应介质，对酶有保护作用[2-4]，近年来各国学者深入研究反胶束中酶的固定化、动力学特征和稳定性等方面[5-7]，拓宽了反胶束技术的应用领域[8,9].Kamyshny等[10]发现葡萄糖氧化酶在反胶束溶液中的酶活力和稳定性远大于水溶液，且活力决定于含水量.Hirakawa等[11]发现AOT/异辛烷体系可增加酵母醇脱氢酶和羟类固醇脱氢酶的稳定性，延长辅酶的再生使用寿命，使辅酶循环再生，总转化率是水溶液中的7倍.

基于反胶束酶体系在以上领域研究较多，而在分析测定方面应用较少，本课题组从酶法测定的角度研究反胶束溶液中的酶催化反应，针对乳酸脱氢酶(LDH)在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)-辛烷-己醇体系中酶的固载量和灵敏度不足[12]，以CTAB-异辛烷-戊醇体系固定化乳酸脱氢酶LDH，探讨含水量、CTAB浓度和戊醇体积比对LDH进入反胶束的影响，比较反胶束固定化酶和游离酶的催化性质，找出适用于酶法测定的条件.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-1100型分光光度计(北京瑞利分析仪器公司),FA2400分析天平(上海精科天平厂)，PHS-3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)，CS2501型超级恒温水浴槽(武汉实验仪器厂).

乳酸标准溶液(9.51mol/L,经标定)，CTAB、辛烷、异辛烷、戊醇(国药集团化学试剂有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl-水合肼缓冲溶液(0.05mol/L)，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，武汉生命技术公司)，LDH(Sigma).

1.2 实验方法

称取一定质量的CTAB，加入戊醇和异辛烷共4mL，边振荡边加入LDH和一定pH的缓冲液，形成均一透明的反胶束固定化LDH体系.

于比色皿中加入3.0mL Tris-HCl-水合肼缓冲液和一定量的游离LDH，或3.0mL反胶束溶液，以0.05mol/L NAD引发反应，测定ΔA340，计算酶活力和相对酶活力.v=ΔA×V/ (Δt×ε×b)，式中v为酶促反应速度(酶活力,μmol/min)， ΔA为吸光度变化值，V为反应液体积(mL)，Δt为时间变化值(min)，ε为摩尔吸收系数(L/(mmol·cm))，b为光程(cm).相对酶活力(Relative activity) = (酶活力/酶活力最大值)×100%.

米氏常数(Km)=[S](Vmax/v―1)，v为酶促反应速度，Vmax为最大酶促反应速度，[S]为底物浓度.(Km值等于Lieweaver-Burk曲线与横坐标交点的倒数).

2 结果与讨论

2.1 含水量、CTAB浓度和戊醇浓度对酶固定化的影响

体系中含水量、CTAB浓度和戊醇浓度对酶固定化的影响见图1.其中含水量W0(W0=n(water)/n(CTAB))是反胶束体系的一个重要参数，其值决定了反胶束水池的尺寸.反胶束水池性质随W0变化且导致酶活变化.由图1a可见，酶活力随含水量变化呈先上升后下降的曲线.当W0值较小时，没有形成清晰透明的反胶束；当W0值为4.3时，酶活力达到最大值；而W0继续增大酶活力反而下降，W0到6时反胶束体系变浑浊.由图1b可见，随着CTAB浓度的增加，LDH活力逐渐增加，当CTAB浓度为0.24mol/L时酶活力达到最大；随后LDH活力逐渐下降，说明CTAB含量过高对反胶束的形成有影响.由图1c可见，戊醇体积比小于10%时不能形成清晰透明的反胶束，随着戊醇体积比的增加，反胶束中LDH活力增加，但超过25%时，酶活力逐渐下降，戊醇最佳体积比为25%.

a) 含水量；b) CTAB浓度；c) 戊醇体积比

2.2 酶学性质

2.2.1 pH值和温度对酶活力的影响

在不同pH值的水溶液和反胶束溶液中分别测定游离酶和固定化酶活力，由于反应介质会影响活性部位中主要基团、酶-底物复合物和底物的解离状态，进而影响酶活力的变化范围，pH值会影响酶活力，结果见图1a.如图1a所示，游离酶和固定化酶动力学反应的最适pH值均为8.8.从pH曲线的陡缓程度可看出，游离酶对pH的变化较固定化酶更为敏感，说明酶经固定化之后更能适应溶液酸碱度的变化.

温度升高使酶活力增大，但温度过高时，酶蛋白的热变性导致酶逐渐丧失活力.在12～60℃测定了温度对游离酶和固定化酶活力的影响，结果见图1b.由图1b可见，游离酶和固定化酶随温度变化的趋势相似，但范围不同，最适反应温度分别为52℃和30℃.

2.2.2 米氏常数的测定

米氏常数(Km)值表示酶对底物亲和力的大小，是酶的特征常数.以乳酸为底物测出游离酶和固定化酶的Km分别为65mmol/L和48mmol/L，结果见图3.比较游离酶和固定化酶的直线，发现固定化后Km减小，说明酶和底物的亲和力增加.

a) pH值；b) 温度

1) 游离酶；2)固定化酶

2.2.3 LDH的活力稳定性

在25℃及最佳介质条件下测定了游离酶和固定化酶的活力稳定性，结果见图4.由图4可见，放置2 h后固定化酶活力损失16%，游离酶损失35%，说明LDH在反胶束体系中更稳定，反胶束可模拟酶的天然环境，较好地保持酶活性.

1) 游离酶；2) 固定化酶

2.2.4 LDH的荧光光谱

固定化酶和游离酶的荧光激发和发射光谱相比有较大不同，由图5可见，游离LDH的激发和发射波长分别为290nm和343nm，而固定化LDH的激发和发射波长分别蓝移了29nm和34nm，表明反胶束中酶分子的构象发生了改变.

1) 固定化酶,激发光谱,λmax=261nm；2) 游离酶,激发光谱,λmax=290nm；3) 固定化酶,发射光谱,λmax=309nm；4) 游离酶,发射光谱,λmax=343nm

3 结论

LDH进入反胶束的最佳条件为：W0=4.3，c(CTAB)=0.24mol/L，φ(pentanol)=25%.游离酶和固定化酶酶促反应的最适pH值均为8.8，最适反应温度分别为52℃和30℃，Km分别为65mmol/L和48mmol/L.在25℃时，游离酶存放2 h后失活35%，而固定化酶仅失活16%，说明反胶束固定化酶具有良好的活力稳定性.

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