UPLC-Q-TOF/MS分析埃博霉素B

王 堃，王延亮，卢育新，丁小军，程晓晨，张庆林

(1.安徽医科大学 研究生院，安徽 合肥 230032;2.北京放射与辐射医学研究所，北京 100850)

埃博霉素(Epothilone)是黏细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)代谢产生的一类十六元大环内酯类化合物，具有与紫杉烷类化合物相似的稳定微管的作用机理［1］，但其抗肿瘤谱更广，对多药耐药性细胞(包括耐紫杉醇类的细胞)具有明显的细胞毒活性［2］。目前，已有埃博霉素同系物已经被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗对紫杉醇耐药的乳腺癌［3］。埃博霉素 B(Epothilone B，Epo B)通过诱导微管蛋白聚合抑制其解聚，稳定微管结构，阻碍纺缍丝的形成，从而抑制肿瘤细胞的生长［4］。

超高效液相色谱(UPLC)技术是近年发展起来的分离技术，已成为天然药物中活性成分的快速分离和鉴定的有力手段［5］。UPLC具有超高压、超高灵敏度、超高分离度等特点［6］。飞行时间串联质谱仪(Q-TOF/MS)的显著特点是高灵敏度、高选择性，能得到高质量质谱图和化合物精确分子质量［7］。UPLC与Q-TOF/MS联用技术(UPLC/Q-TOF/MS)是目前分析复杂系统的有效方法［8］。

目前，Epo B主要时通过微生物发酵的方法来获得。在以前的研究中我们建立了Epo B高效液相色谱(HPLC)分析方法［9］。UPLC-MS/MS较 HPLC分析时间短，样品用量小，溶剂的消耗少，提高了灵敏度和分离效率。本文在前期研究的基础上，用UPLC-MS/MS对Epo B纯化产品及发酵液提取物进行分析，为Epo B纯化产品的质量控制，发酵液中Epo B的产量及高产菌株的筛选研究奠定了基础。

1 材料

Epo B对照品、Epo A对照品、Epo B纯化产品、发酵液提取物，自制;甲醇(色谱纯)，美国Fisher公司;甲酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;超纯水经Millipore纯水系统纯化。

UPLC-MS/MS联用系统、Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(包括光电二极管阵列(PDA)检测器、自动进样系统及恒压泵动力系统)、Waters AcquitySynapt MS系统，美国 Waters公司;Millipore Simplicity纯水仪。

2 方法

2.1 对照品溶液

取Epo B及Epo A对照品约10.0 mg，精密称定，分别用甲醇溶解，配制成浓度约为2.0 mg/mL的对照品溶液，分别吸取1 mL，混合，配制成混合对照品溶液，供筛选UPLC分析条件用。

2.2 样品溶液

称取Epo B纯化产品6.4 mg，用甲醇溶解，配制成浓度约为2.0 mg/mL的供试液。

实验室摇瓶发酵液(4 L)，用大孔树脂吸附后取适量，乙酸乙酯提取后减压浓缩，浓缩物甲醇溶解后离心取上清，作为发酵提取物的供试液。

2.3 UPLC色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC®HSS T3(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色谱柱;柱温为30 ℃，流速为0.3 mL/min;流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序为0～2 min，40%B;2～5 min，40%→60%B;5～7 min，60%→70%B;7～10 min，70%→100%B;10～13 min，100%B;13～15 min，100%→40%B。

2.4 质谱条件

采用电喷雾电离离子源(ESI)，负离子V模式检测;m/z范围为70～1 200，毛细管电压为3 kV，锥孔电压为40 kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温度为450℃，脱溶剂气体流速为900 L/h，锥孔气流量50 L/h，质量校正 m/z 554.261 5。

3 结果与讨论

3.1 Epo A和Epo B混合对照品溶液UPLC分析

取Epo A和Epo B的混合对照品溶液(约0.5 mg/mL)采用2.3项下的的色谱条件进行UPLC分析，进样量为2.0 μL。色谱图见图1。Epo A的保留时间(tR)为3.915 min，Epo B 为4.320 min，两者能够实现基线分离。

本实验分别考察了甲醇-0.1%甲酸溶液恒比和甲醇-0.1%甲酸溶液梯度条件，结果显示甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脱时各峰的分离度较好，且基线平稳，峰型较好有利于进一步的分析，因此最终选择甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脱作为流动相系统。

图1 Epo A和Epo B的混合对照品梯度洗脱UPLC-PDA图Fig.1 The UPLC-PDA spectrum by gradient elution of Epo A and Epo B

3.2 Epo A和Epo B混合对照品溶液质谱分析

将Epo A和Epo B的混合对照品溶液逐步稀释制成约1 μg/mL的溶液，按2.4项下的质谱条件质谱分析，进样量为1.0 μL。从图2中可以看出Epo A 的［M-H］-为 492.243 0，［M+HCOO］-为538.249 0，理论分子质量为493.249 8，Epo B的［M-H］-为506.259 8，［M+HCOO］-为552.264 3，理论分子质量为507.265 5。

图2 Epo A和Epo B的混合溶液稀释后质谱分析图Fig.2 The mass spectrum of the mixed solution of the Epo B and Epo A

3.3 Epo B纯化产品的UPLC-MS分析

精密量取浓度约为2.0 mg/mL的Epo B纯化产品供试液1.0 μL，注入色谱仪。结果见图3～4。由图3中可知，Epo B纯化产品用UPLC-MS分析，经检测PDA图谱与总离子流色谱图(TIC)图谱保留时间一致，除了主成分 Epo B(tR=4.41min，［MH］-=506.259 9，［M+HCOO］-=552.266 6)外，提取离子图还能检测出微量的主要杂质Epo A存在(tR=3.98 min，［M-H］-=492.244 9，［M+HCOO］-=538.248 6)。

目前EpoB主要通过大孔树脂提取分离再经HPLC纯化制得，纯化后应用UPLC-MS对Epo B进行检测、分析对于改进分离制备工艺提高纯度以及杂质鉴定具有指导意义。

图3 Epo B纯化产品供试液UPLC-PDA及TIC图谱Fig.3 The UPLC-PDA and TIC spectrum of the purified products

图4 Epo B纯化产品供试液的质谱图Fig.4 The mass spectrum of Epo B purified product

3.4 UPLC-MS分析发酵液提取物

精密量取发酵提取物的供试液1.5 μL，注入色谱仪，结果见图5～6。由图5可知，发酵液提取物供试液主成分Epo B的tR=4.40 min，已知杂质Epo A的tR=3.99 min，与其他杂质可以基线分离，提取与对照品tR一致的谱峰，质谱图与图2一致。

目前，Epo B主要通过微生物发酵方法获得。应用UPLC-MS对发酵过程中Epo B的含量进行跟踪检测，对于改进工艺，提高代谢物产量具有重要的指导意义，也可用于筛选高产菌株。

图5 Epo B发酵液提取物供试液UPLC-PDA及TIC图谱Fig.5 The UPLC-PDA and TIC spectrum of the fermentation broth extracts

图6 Epo B发酵液提取物供试液的主成分质谱图Fig.6 The mass spectrum of Epo A and Epo B in the fermentation broth extracts

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