龙心素胶囊质量标准提高研究

张 利，赵 军，赵钐妤

(1.云南省食品药品检验所，云南 昆明 650011;2.云南永安制药有限公司，云南 曲靖 655000;3.云南大理学院 药学院，云南 大理 671000)

龙心素胶囊为鲜地龙经适宜方法加工制成的胶囊剂，其功能主治为活血通络，用于淤血阻络所致的缺血性中风，症见半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜［1］。龙心素胶囊的主要活性成分为鲜地龙中的水解蛋白酶——蚓激酶［2］，它能够明显改善神经功能缺损程度及血液流变学各项指标，在治疗心脑血管疾病方面疗效确切［3］。目前，蚓激酶活性测定主要有对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)法［4］，光散射法［5］，TPA-纤维蛋白平板法［6］及琼脂糖纤维蛋白平板法［7］。龙心素胶囊原质量标准［1］活性测定采用琼脂糖纤维蛋白平板法，以溶圈面积表示样品的活性单位，测定误差偏大，且用面积表示效价很难与其他含蚓激酶产品的效价相比较。考虑到琼脂糖纤维蛋白平板法简便易行，本研究对龙心素胶囊的活性测定方法进行了改进，并改进原标准的鉴别方法，对样品的重金属与砷盐进行检查。

1 仪器与试药

游标卡尺(上海量具刃具厂);超声仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

龙心素胶囊 10批(批号:100901，100902，100701，110101，110102，101101，101102，101103，101104，101105)，云南永安制药有限公司;牛纤维蛋白原(批号:200736，200232)、牛凝血酶(批号:605-0123，605-9822，622-9906)、蚓激酶标准品(批号:200301，200502)，中国药品生物制品检定所;琼脂糖(批号:100107)，上海伯奥生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 鉴别

(1)取琼脂糖纤维蛋白平板一个，吸取生理盐水和2.3.2.2项下供试品各10 μL，分别点于板上，在37℃恒温培养18 h。供试品有明显溶圈，生理盐水无明显溶圈。

(2)取本品内容物0.1 g，加生理盐水2 mL，振摇5 min，离心，取上清液1 mL，加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL，溶液变浑浊。

结果表明，10批样品鉴别均呈正反应。

2.2 检查

照《中国药典》(2010版，二部)的方法进行重金属与砷盐检查，结果表明，10批样品重金属含量未过百万分之二十，砷盐含量未过百万分之二。

2.3 活性测定

2.3.1 影响因素考察

2.3.1.1 溶剂 取相同重量的供试品两份(批号:100903)，分别用原标准的硼砂缓冲液(pH 7.8)及生理盐水溶解供试品，各点8个点，结果显示同一浓度的供试液溶圈平均直径分别为2.265与2.242 cm，说明溶剂对结果的影响较小，考虑方便易行，故选用生理盐水为溶剂。

2.3.1.2 琼脂糖与纤维蛋白原 据报道［7］，琼脂糖纤维蛋白平板法测定蚓激酶效价，溶圈面积不易受不同批次的琼脂糖及纤维蛋白原的影响。

分别用0.05%，0.3%和0.5%的琼脂糖制成不同的纤维蛋白平板进行试验，结果表明，琼脂浓度越大，溶圈面积越小。以0.05%琼脂糖试验其溶圈面积大且不规则，易变形，0.5%的琼脂溶液制成的纤维蛋白平板得到的溶圈形状较规则，大小适中，不易因抖动而变形。

2.3.1.3 提取时间 采用不同超声提取时间考察对同一批样品(批号100903)的蚓激酶的提取效果，结果超声10与30 min效果一致，故选择10 min。

2.3.1.4 培养时间 同一供试品(批号100903)的溶液分别恒温培养15，18和21 h后测定溶圈面积，结果18 h时的面积比15 h时的面积有所扩大，而18 h与21 h的面积基本相同，所以选择18 h。

2.3.1.5 纤维蛋白平板放置时间 原标准要求放置1 h，根据试验结果放置0.5与1 h结果一致。

2.3.2 测定方法

2.3.2.1 标准品溶液的制备 取蚓激酶标准品，按标示效价用生理盐水分别稀释成每1 mL含12 500与25 000 U的2种浓度的溶液(S1、S2)。

2.3.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物适量，按估计效价照标准品溶液的制备法制成2种同样的浓度梯度的溶液(T1、T2)，供试品和标准品高低剂量所致的反应均值应相近，超声提取10 min，离心，取上清液作为供试品溶液。

2.3.2.3 0.5%琼脂糖溶液的制备 取琼脂糖0.5 g，加入硼砂缓冲液(pH 7.8)100 mL，加热煮沸，置60℃水浴中平衡，备用。

2.3.2.4 纤维蛋白原溶液的制备 取牛纤维蛋白原适量，用硼砂缓冲液(pH 7.8)制成每1 mL含可凝结蛋白2 mg的溶液。

2.3.2.5 凝血酶溶液的制备 取牛凝血酶用硼砂缓冲液(pH 7.8)制成每1 mL含40 BP单位的溶液，即得。

2.3.2.6 纤维蛋白平板的制备 取已消毒的培养皿(直径90 mm)，吸取纤维蛋白原溶液8 mL于平皿中，快速吸取0.5%琼脂糖溶液2 mL和凝血酶溶液0.5 mL加入培养皿中，充分混匀，水平放置0.5 h。

2.3.2.7 测定法 取纤维蛋白平板不少于4只，取不同标准品溶液及供试品溶液各10 μL，分别点于同一平板(高低剂量呈对角点样)，加盖，置37℃培养18 h，取出，溶纤后形成的斑点用0.25%番红花染色液染色，分别用游标卡尺测定斑点垂直两直径(长短径)，以平均直径计算面积，将溶圈面积换算成对数，照生物检定统计法中量反应平行线(2.2)法计算蚓激酶的效价，可信限率(FL%)不得大于20%。

2.3.3 方法学研究

2.3.3.1 线性 取蚓激酶标准品加生理盐水分别制成每 1 mL 含蚓激酶 33 000，26 400，19 800，9 900，8 250 U 的标准溶液，分别取10 μL点样，测定溶圈面积，以浓度为横坐标(X)，溶圈面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程:Y=0.804 3 X+1.426 9，r=0.998 6。表明蚓激酶在8 250～33 000 U/mL范围内与溶圈面积呈良好的线性关系。

2.3.3.2 专属性 以处方比例按2.3.2.2项下方法制成不含鲜地龙的阴性对照溶液，将与样品含量一致的标准品添加至阴性对照溶液中，制备空白回收样品。按活性测定方法测定，结果显色剂未发生扩散，即在阴性对照样品处未出现溶圈，而空白回收样品处溶圈与样品一致，证明阴性对照无干扰。

2.3.3.3 精密度 取同一浓度的供试液(批号:100903)，取5个培养皿，在每个培养皿上点4个点，测定每个点的溶圈面积，结果RSD为4.71%。

2.3.3.4 重复性 取供试品(批号:100903)6份，测定蚓激酶效价，结果RSD为6.54%。

2.3.3.5 稳定性试验 取储存于4℃下同一供试品溶液，分别在0，24，48和72 h点样，测定其溶圈面积，结果表明，供试品溶液在4℃下72 h稳定。

2.3.3.6 回收率试验 取已知含量样品(批号:100703，效价810.7 U/mg)，取9份(每份约0.31 g)，分别精密称定，再精密称取蚓激酶原料(批号:100701，效价8 760.3 U/mg)9份(相当于含量的120%，100%和80%，各3份)，分别加入样品中，按效价测定方法测定，结果见表1，平均回收率为94.63%，RSD为7.69%。

表1 加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.3.4 样品测定 对10批样品进行效价测定，用量反应平行线(2.2)法计算效价，结果见表2。根据10批样品的效价测定可信限率实验结果，对误差的控制要求为本法的可信限率FL(%)在20%内。效价平均值为788.1 U/mg，考虑到原料来源及测定误差等因素，按平均值下移20%作为限度，规定每1 mg供试品蚓激酶效价应不少于630 U。

3 讨论

表2 10批样品的活性测定Tab.2 The activity determination of 10 batches of sample

原标准的两项鉴别均为酶的化学反应方法，专属性不强，本研究采用蚓激酶活性测定法代替其中的第1项鉴别，使之能反应出蚓激酶的活性特征。

本研究考查了10批样品的重金属及砷盐含量，结果均未过规定，故重金属及砷盐检查可不列入标准。

本研究确定改用0.5%琼脂糖制纤维蛋白平板、用生理盐水提取并超声10 min等条件，使得到的溶圈形状规则，结果更准确，操作更简便、快速。

原标准仅以溶圈面积表示样品的活性单位，其结果易受实验条件及人为因素的影响，误差较大。本法引入蚓激酶标准品，减少了外界因素的影响，采用操作简单、方便的量反应平行线(2.2)法计算效价，研究结果及对可信限率(FL%)的控制要求与文献［7］采用的量反应平行线(3.3)法基本一致。另外因效价测定时所需测量的溶圈透明，边缘难确定，易造成人为误差，本研究采用染色剂对溶圈进行染色，使溶圈边缘更直观，易于测量，减小了误差。

［1］ WS-10005(ZD-0005)-2004，国家食品药品监督管理局标准(试行)，龙心素胶囊［S］.

［2］ 周 海，王春维，张 怡，等.蚓激酶的提取纯化及性质研究［J］.中国生化药物杂志，2011，32(3):212-216.

［3］ 滕文姣，孙晋民.蚓激酶的药学与临床研究进展［J］.西北药学杂志，2011，26(1):69-70.

［4］ 李剑梅，苗玉琨，李 鑫.TAME法对康脂口服液中蚓激酶单位效价的测定［J］.微生物学杂志，2004，21(3):61.

［5］ 周 靓，姜 葵，赫荣乔.光散射法测凝血酶、水蛭素及蚓激酶活性［J］.生物物理学报，1997，13(4):531.

［6］ 李 群，周淑平，纪 宏，等.蚓激酶及其制剂活性测定的研究［J］.中国药事，1998，12(5):286-287，289.

［7］ 董培智，朴晋华，党爱华，等.量反应平行线法在溶栓胶囊蚓激酶效价测定方法学研究中的应用［J］.中国中药杂志，2010，35(11):1410-1414.