高通量筛选在微生物制药中的应用进展

沈辰，郑珩，顾觉奋

高通量筛选（high throughput screening，HTS）又称大规模集群式筛选，是由高容量化合物库、自动化操作、高灵敏度检测、高特异筛选模型、高效率数据处理 5 个子系统有机组合而成，是一种新型、高自动化、高灵敏度、高通量的发现新药的筛选技术。其理论基础是反向药理学（reverse pharmacology），即基于受体、酶及离子通道等分子、细胞水平药物作用靶点，从现有化合物库中筛选出具有生物活性的先导化合物，在此基础上再进行组织、器官及疾病相关动物模型研究。

利用药物作用靶点进行药物筛选，已成功地发现了大批临床用药。如血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利、依那普利等降血压药物，β-肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔、阿替洛尔等，都是利用分子靶点筛选发现并经过进一步研究而成为临床应用的药物。这些研究成果更加强了人们对高通量药物筛选的信心。目前，世界上大型制药企业都无一例外地将其作为驱动新药发现的强力引擎，纷纷引进新药研发领域，使高通量筛选的形式和内容不断丰富发展[1]。近年来，高通量筛选技术不仅广泛应用于化学新药的筛选，同时在生物催化剂[2]，RNAi[3]，蛋白质类药物[4]等的筛选过程中也有所应用。

高通量筛选技术具有以下几方面的发展趋势：①采用基于细胞的分析筛选方法，可直接在活细胞内检测化合物，提高筛选的准确性；②采用精确的检测技术，使之能够在相同的分析过程中兼顾效率和特异性；③基于功能基因组学的药物高通量筛选逐渐受到重视并应用；④开始分析和处理工业中的实际问题。该系统在后基因组时代研究和药物发现之间架起桥梁，将很快渗入到未来市场中，打破从基因到药物研发链条中的瓶颈[5]。

1 高通量筛选应用于微生物药物早期发现中的优势

高通量筛选技术主要应用于筛选利用组合化学制备的大规模化合物库[6]，虽然筛选效率大为提高，但得势不得力，其获得新的化学实体的数量并没有显著提高，而且随着新药标准的提高，新的化学实体数量反而呈下降趋势。因此，天然产物作为创新药物的筛选资源再次受到重视[7]。

相对于动植物代谢产物来讲，微生物次级代谢产物具有更易开发利用、不破坏生态环境、可通过发酵大量获得和易于采用生物技术等优点[8]。目前已有众多微生物次级代谢产物开发成为药物。抗生素作为其中的典型代表，在治疗感染性疾病，保障人类健康方面取得了令人瞩目的成就。同时它不仅应用于临床，也可用于农业和畜牧业，是一类应用最广泛的药物。随着生命科学与医药学的发展，由微生物产生的具有其他生理活性的物质也不断被发现，如受体拮抗剂和激动剂、酶抑制剂和诱导剂、免疫调节剂等，更丰富了微生物药物生理活性的多样性。

近年来随着人们对极端环境微生物，海洋微生物的探索，发现了大量未知的微生物物种及微生物次级代谢产物。同时伴随着生物技术的发展，在基因工程、代谢工程、组合生物合成的推动下，通过构建工程菌株，获得了大量结构新颖的微生物次级代谢产物，扩充着微生物次级代谢产物的种类和数量[9]。利用有效的筛选手段对其进行筛选，将极大地促进创新型微生物药物的早期发现和苗头化合物的获得。而传统的筛选方法由于处理量少，效率低，面对大批量化合物处理时，需要消耗更多的人力和物力，已不能适应当前大规模微生物代谢产物的筛选要求。高通量筛选技术弥补了传统筛选方法的不足，能够快速而高效地在庞大的微生物次级代谢产物库中发现目标化合物。随着微生物次级代谢产物库的建立和日趋完善，微生物次级代谢产物的筛选更加方便和快捷，对我国创新微生物药物的开发起到极大的推动作用。

2 微生物药物高通量筛选样品库发展现状

目前微生物制药领域中可供高通量筛选的样品资源库主要包括微生物菌株库及微生物发酵产物提取品库等。

随着化学分离手段的进步与发展，以及我国在药物研发经费投入的加大，在我国开展规模化微生物次级代谢产物纯品库已经成为可能，而且也十分必要，这是创新型微生物药物快速高效发现的必然要求。

在我国，科技部自“九五”期间开始资助支持国内筹建国家新药（微生物）筛选实验室，“十五”、“十一五”期间又以筛选平台的形式资助支持微生物药物高效筛选。十年来，我国微生物药物的筛选技术有了长足的进步。在药物筛选微生物资源方面已经建立了近 15 万株的筛选用菌株库和 20 万个微生物发酵液提取品的样品库。高通量微生物药物筛选模型已达到 150 种，年筛选量已由“十五”期间的20 万样次，发展到“十一五”期间的 100 万样次。通过大量的规模化的筛选，已经获得一批药物先导化合物和药物候选物，有些已经进入临床前研究阶段。就微生物药物的筛选规模和水平来讲，我国的创新微生物药物筛选已达到国际先进水平[8, 10]。

3 高通量筛选在微生物制药领域中的应用

高通量筛选技术不仅推动了创新型化学类新药的研发进程，近年来，在创新型微生物类新药研发过程中的应用也日趋广泛。以下主要介绍近年来高通量筛选技术在微生物制药领域应用最为广泛的两个方面——先导化合物的发现及菌种筛选。

3.1 在微生物来源的先导化合物发现中的应用

3.1.1 针对微生物代谢产物化合物库的高通量筛选 针对微生物代谢产物化合物库的高通量筛选过程一般为首先构建适宜的高通量筛选模型，再利用微量滴定板对微生物代谢产物库中的化合物进行高通量筛选，通过相应的检测技术筛选目标化合物，最后对目标化合物进行活性验证，以获得可供进一步开发的先导化合物。

正如前文所述，国家新药（微生物）筛选中心样品库的建立和发展已极大地促进了微生物药物先导化合物的发现，相关研究者根据不同靶点，对样品库中的化合物进行筛选，已经获得了大量微生物来源的具有不同生理活性的先导化合物。

在丙型肝炎病毒（HCV）丝氨酸蛋白水解酶抑制剂的高通量筛选过程中，李健蕊等[11]利用基因重组的方法将含有丝氨酸蛋白水解酶基因的质粒转化到大肠杆菌中表达，结合荧光共振能量转移法（FRET）成功构建了适用于高通量筛选的特异性蛋白酶抑制剂筛选模型。利用此模型，对样品库中的 4000 个化合物进行初步筛选，获得了 4 个具有抗丙肝病毒活性的化合物。

在以 FOXP3 为靶点的免疫抑制剂的高通量筛选过程中，巫晔翔等[12]将转录因子 FOXP3 基因启动子克隆至含有与报告基因 β-内酰胺酶相偶联的表达载体中，并转染至Jurkat 细胞株中稳定表达，建立了适宜高通量筛选的模型，进而对样品库中 2500 余种化合物进行筛选，获得 4 个具有免疫抑制活性的化合物。

在以 ApoA-1 为靶点的基因表达上调剂的高通量筛选过程中，杜郁等[13]构建了重组荧光素酶报告基因质粒并转染至人肝癌细胞 HepG2，利用荧光素酶表达活性的变化为检测指标，成功构建了 ApoA-1 基因表达上调剂高通量筛选模型。对样品库中 5000 余种化合物进行筛选，获得4 个具有治疗动脉粥样硬化潜力的活性化合物。

由此可见，以微生物代谢产物化合物库为对象的筛选，与组合化学品库的高通量筛选虽然筛选对象不同，但原理与方法基本相同，所以该方法较为成熟、规范。

3.1.2 针对微生物发酵液提取品库的高通量筛选 微生物代谢产物中含有大量不为人知的新型化合物，在现有的微生物代谢产物化合物库中不能保证完全收纳。同时，不同类型的微生物代谢产物的药理活性会有所侧重，在针对某一靶点筛选先导化合物时，选择特定类型的微生物的代谢产物提取物进行筛选，将会提高效率，事半功倍。所以针对微生物发酵液提取品的高通量筛选是十分必要的，是对微生物天然代谢产物化合物库高通量筛选的重要补充。

针对微生物发酵液提取品库的高通量筛选过程，通常是将微生物发酵提取物加入到微量滴定板中，通过相应的筛选模型，从大规模的微生物发酵液提取物中获得目标阳性样品——特定菌株发酵液提取物，进而对特定菌株进行放大发酵、活性产物提取、分离，获得活性组分后进行结构分析和药理活性测定，以得到先导化合物。

在 H1N1 神经酰胺酶抑制剂的筛选过程中，Lin 等[14]利用基因工程手段将截短型 H1N1 神经酰胺酶基因克隆到载体中，构建重组质粒并转化至毕赤酵母中，获得了能够分泌表达截短型 H1N1 神经酰胺酶的重组菌株，构建了新型神经酰胺酶抑制剂的高通量筛选模型。利用此模型对20 000 多个微生物发酵液提取物进行了筛选，获得 6 种活性提取物。

近年来，随着海洋微生物，极端环境微生物的探索与开发，大量的新型菌株以及独特结构的次级代谢产物被发现，这为创新微生物药物的研发开辟了新的思路。科研人员通过对大量的海洋或极端环境等新分离菌株发酵提取品进行高通量筛选，获得了更多具有独特生理活性的天然产物及其生产菌株。

在钙调磷酸激酶抑制剂的筛选过程中，Margassery 等[15]对海洋微生物发酵提取品进行了高通量筛选。研究者将含有CDRE::lacZ 融合基因的 Pmrk212 质粒导入酵母细胞中，获得酵母报告菌株，以紫外吸收光谱作为检测方法，构建了钙调磷酸激酶抑制剂的高通量筛选模型。然后对 81 个海洋海绵动物中所分离的微生物发酵提取物进行筛选，发现3 个菌株的发酵提取物具有钙调磷酸激酶抑制活性，其菌株编号分别为 SM8、FMK7A、FMK1B。

总之，针对微生物代谢产物的高通量筛选，可分别以微生物天然代谢产物化合物库及微生物发酵提取物为筛选对象来进行，两者互相渗透，相辅相成，其最终目标均为高效率地获得药物先导化合物。近年来，高通量筛选技术在微生物来源的先导化合物早期发现过程中的应用在国内蓬勃发展，并在创新型微生物药物的开发过程中发挥了极大的作用。表 1 总结了国内近年来微生物代谢产物高通量筛选的部分案例。

3.2 在菌株筛选中的应用

微生物具有数量大，种类多，分布广的特点，绝大部分微生物菌种并未充分开发，潜力巨大。因此，从大量的微生物菌株中筛选出所期望的目标菌株，在微生物药物发现的过程中具有重要的意义。

针对微生物菌株的高通量筛选，其目的是获得具有某一特定性质的菌株，筛选对象可以是自然界中分离所得的菌株，可以是原始菌株的突变株，也可以是通过生物技术改造的工程菌株等。在筛选过程中，开发合适的培养基，对微生物进行适宜微量滴定板的缩小化培养，以便将微生物菌株直接置于微量滴定板中进行生长繁殖。利用多种检测技术对目的产物的浓度或菌株的各项生理生化指标进行测定，获得阳性菌株，进而通过复筛，最终获得目的菌株——某一特定性质的菌株。

表 1 国内微生物代谢产物高通量筛选案例小结

表 2 国内微生物菌株高通量筛选案例小结

Gao 等[19]利用高通量筛选方法，从原始菌株 Streptomyces avermitilis 系列突变株中成功筛选出阿维菌素高产菌株，其产量提高 60%。在高通量筛选模型的构建过程中，研究者利用固体培养基代替传统的液体培养基，从而可在 96 孔微量滴定板中成功培养 S.avermitilis 系列突变株。同时利用245 nm 紫外吸收值检测阿维菌素的产量来代替高效液相色谱的检测方法，适合于对微量滴定板的检测。利用建立好的高通量筛选模型，对由原始菌株突变所获得的 738 株突变株进行了高通量筛选。其中在初筛（preliminary screen）过程中采用了高通量筛选技术。经过初筛共获得 116 株进入复筛阶段（second screen），最终证实有 38 株的产量比原始菌株提高了 10%。

针对微生物菌株的高通量筛选，是高通量筛选技术在微生物制药领域中的一个独特的应用，在我国，近年来也涌现出一些相关的案例（表 2）。

4 小结

微生物代谢产物因其种类繁多，结构复杂，可广泛应用于医药、食品、化工、材料等领域中，是自然界的宝贵财富，但正是因其庞大的数量，一般的筛选方法仅能对少量的代谢产物或菌株进行筛选，这便大大限制了人类对于微生物天然代谢产物的开发利用。高通量筛选作为 20 世纪 80 年代兴起的方法，如今已经广泛应用于化合物筛选中。近几年，高通量筛选新技术的发展也大大提高了筛选效率，推动了一大批化合物进入临床研究。在微生物制药领域中高通量筛选也逐渐渗入并发挥了积极的作用，但还存在一些问题：第一，高通量筛选主要关注于小分子化合物库的筛选，而在微生物代谢产物中的筛选涉足较少；第二，专门的微生物代谢产物库并未系统化建立；第三，新的作用靶点和微量分析方法还需要进一步探索。总之，高通量筛选作为新兴的筛选手段，与现代药物筛选技术结合并应用于微生物代谢产物的筛选过程中，将会极大地推动微生物制药的发展。

[1] Mayr LM, Bojanic D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9(5):580-588.

[2] Wahler D, Reymond JL. High-throughput screening for biocatalysts.Curr Opin Biotechnol, 2001, 12(6):535-544.

[3] Theis M, Buchholz F. High-throughput RNAi screening in mammalian cells with esiRNAs. Methods, 2011, 53(4):424-429.

[4] Capelle MA, Gurny R, Arvinte T. High throughput screening of protein fomulation stability: practical considerations. Eur J Pharm Biopharm, 2007, 65(2):131-148.

[5] Mishra KP, Ganju L, Sairam M, et al. A review of high throughput technology for the screening of natural products. Biomed Pharmacother, 2008, 62(2):94-98.

[6] Macarron R, Banks MN, Bojanic D, et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov, 2011, 10(3):188-195.

[7] Wang BC, Deng J, Gao Y, et al. The screening toolbox of bioactive substances from natural products: a review. Fitoterapia, 2011, 82(8):1141-1151.

[8] Si SY, Jiang W, Bai SK. Advances in microbial drug research and development. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):81-83. (in Chinese)司书毅, 姜威, 白硕可. 微生物药物研究进展与发展趋势. 中国医药生物技术, 2011, 6(2):81-83.

[9] Knight V, Sanglier JJ, DiTullio D, et al. Diversifying microbal natural products for drug discovery. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(5-6):446-458.

[10] Jiang W, Si SY, Chen XP, et al. Development and application of microbial natural products database. Chin J Antibiot, 2006, 31(2):119-121. (in Chinese)姜威, 司书毅, 陈湘萍, 等. 微生物天然产物数据库的建立及应用.中国抗生素杂志, 2006, 31(2):119-121.

[11] Li JR, Wu YB, Si SY, et al. Establishment and application of high throughput screening model for hepatitis C virus NS3-4A protease inhibitors in vitro. Acta Acad Med Sinicae, 2011, 33(1):98-101. (in Chinese)李健蕊, 武燕彬, 司书毅, 等. 丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用. 中国医学科学院学报, 2011, 33(1):98-101.

[12] Wu YX, Si SY, Jiang JD, et al. Screening model for immuning inhibitors as target for transcription factor FOXP3. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(1):2-6. (in Chinese)巫晔翔, 司书毅, 蒋建东, 等. 以 FOXP3 为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型的建立. 中国医药生物技术, 2011, 6(1):2-6.

[13] Du Y, Wang L, Wang LF, et al. Estabilishment of a high-throughput screening model for identifying up-regulator of human Apo A-I expression. Chin Med Biotechnol, 2011, 6(3):178-183. (in Chinese)杜郁, 王丽, 王丽非, 等. 以Apo A-I 为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立. 中国医药生物技术, 2011, 6(3):178-183.

[14] Lin J, Hu HF, Hu YJ, et al. Expression of a truncated H1N1 neuraminidase and high-throughput screening of its inhibitor. Chin J Nat Med, 2011, 9(5):380-384.

[15] Margassery LM, Kennedy J, O'Gara F, et al. A high-throughput screen to identify novel calcineurin inhibitors. J Microbiol Methods, 2012,88(1):63-66.

[16] Liu XH, Hong B, Wang LF, et al. Establishment of a drug screening model for identifying up-regulator of human high density lipoprotein receptor. Acta Acad Med Sinicae, 2004, 26(4):354-358. (in Chinese)刘晓辉, 洪斌, 王丽非, 等. 人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的建立. 中国医学科院学报, 2004, 26(4):354-358.

[17] Qi XZ, Ren LM, Zheng F, et al. High-throughput screening of human pancreatic α-amylase inhibitors. Acta Microbiologica Sinica, 2011,51(8):1106-1112. (in Chinese)齐西珍, 任丽梅, 郑芳, 等. 人胰腺 α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用. 微生物学报, 2011, 51(8):1106-1112.

[18] Zhang L, Yan K, Zhang Y, et al. High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combination agents for the treatment of fungal infections. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(11):4606-4611.

[19] Gao H, Liu M, Zhang X, et al. Identification of avermectin-highproducing strains by high-throughput screening methods. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(4):1219-1225.

[20] Pei G, Dai HQ, Ren B, et al. Exploiting bioactive Enediynes from marine microbe based on activity and gene screening. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(4):472-477. (in Chinese)裴刚, 代焕琴, 任彪, 等. 基于活性和基因从海洋微生物中筛选烯二炔类抗生素. 微生物学报, 2010, 50(4):472-477.

[21] Yang Y, Yuan S, Dai YJ, et al. Microplate for high throughput screening of 6-hydroxynicotinic acid transforming strains. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(1):112-115. (in Chinese)杨瑶, 袁生, 戴亦军, 等. 基于微孔板的高通量筛选 6-羟基烟酸转化菌方法的建立. 微生物学报, 2008, 48(1):112-115.