LC－MS/MS法测定人血浆中氨氯地平的浓度

王 燕，李鹏飞，马 萍，安卓玲，张 茜，罗 恋，刘丽宏

（1.第二炮兵总医院药学部，北京 100088；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065）

氨氯地平是一种1，4－二氢吡啶类的钙离子拮抗剂，阻滞心肌和血管平滑肌细胞外钙离子经细胞膜的钙离子通道进入细胞，直接舒张血管平滑肌，临床主要用于治疗高血压和心绞痛。与同类型的其他药物相比，该药具有服药剂量低、药效维持时间长等特点，目前已成为临床一线用药。文献报道生物样品中氨氯地平浓度测定的方法，主要有气相色谱法（GC）[1]，高效液相色谱（HPLC）法[2－3]，液 相色谱－串 联质谱 （LC－MS/MS）[4－14]法，酶联吸附免疫分析（ELISA）[15]法等。针对以往检测方法检测限低，样本前处理过程复杂、费时的缺点，本实验拟建立一种灵敏度更高、样本前处理过程简便省时的LC－MS/MS法，旨在用于准确测定人血浆中氨氯地平含量，并用于氨氯地平的药动学和生物等效性研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器

3200Q－trap型液相色谱－串联质谱仪：配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1数据处理软件，美国Applied Biosystem公司产品；Agilent 1100高效液相色谱系统：包括四元输液泵，自动进样器，切换阀，美国 Agilent公司产品。

1.2 主要试剂

苯磺酸氨氯地平对照品：中国药品生物制品检定所提供，批号100374－200903，含量99.4%；替米沙坦对照品：广州清平制药有限公司产品，批号M060601，含量99.8%；甲醇、乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析纯；空白人血浆由第二炮兵总医院血液科提供。

1.3 溶液的配制

储备液：精密称取6.83mg苯磺酸氨氯地平对照品（含氨氯地平5mg），置于5mL量瓶中，加V（乙腈）∶V（水）＝80∶20的溶液溶解，并稀释至刻度，配制成1.000g/L的氨氯地平储备液。

标准系列溶液：将1.000g/L的氨氯地平储备液用乙腈逐级稀释到100.000μg/L的母液。分别取适量母液，用乙腈稀释至标准曲线所需浓度，氨氯地平溶液的浓度分别为0.100、0.300、1.000、3.000、10.000、20.000μg/L。分别取适量母液，用乙腈稀释至质控样本所需浓度，低、中、高浓度分别为0.300、3.000、16.000μg/L。

内标：精密称取10.00mg替米沙坦对照品，置于100mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成0.100g/L的储备液。取适量替米沙坦储备液用乙腈稀释至浓度为5.000μg/L，作为内标溶液。

1.4 LC－MS/MS分析条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB－C18柱（4.6×150mm×5μm）；流动相：甲醇－1mM 乙酸铵溶液－0.1%甲酸溶液梯度洗脱，梯度条件列于表1；流速：1 000μL/min，分流比1∶1；柱温：25℃；进样量：20μL。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Condition of gradient elution

1.4.2 质谱条件 离子源：离子喷雾离子化源；离子喷射电压：5 500V；温度：580℃；源内气体1（GS1，N2）压力：310kPa；气体2（GS2，N2）压力：379kPa；气帘气体（N2）压力：103kPa；扫描方式为多重反应监测（MRM）；碰撞气（N2）压力：Medium；氨氯地平、替米沙坦解簇电压（DP）均为：34V；碰撞电压（CE）分别为：14eV、50 eV；氨氯地平、替米沙坦用于定量分析的离子反应分别为 m/z 409.2→238.1和m/z 515.1→276.1。

1.5 血浆样品处理

向1.5mL EP管中依次加入血浆样本100 μL，乙腈溶液100μL，替米沙坦内标溶液100 μL，涡流30s，以13 200r/min离心5min。取150μL上清液进行LC－MS/MS分析，进样量20 μL。

2 方法与结果

2.1 质谱分析

将氨氯地平、替米沙坦储备液用乙腈稀释至50.000μg/L，采用蠕动泵模式进样，按1.4.2项操作，进行碎片离子分析，相应的二级全扫描质谱图示于图1。

图1 氨氯地平（a）、内标替米沙坦（b）的 [M＋H]＋的二级全扫描质谱图Fig.1 Full－scan product ion spectra of[M＋H]＋for Amlodipine（a）and internal standard Telmisartan（b）

2.2 特异性考察

分别取受试者的空白血浆、空白血浆添加标准系列溶液、给药后实际样本，按1.5项处理3个样品，进样20μL，其色谱图示于图2。氨氯地平和内标替米沙坦的保留时间分别为3.40和3.88min，单个样本的测试时间为5.5min。结果表明：内源性物质不干扰氨氯地平和替米沙坦的测定。

图2 LC－MS/MS测定人血浆中氨氯地平（Ⅰ）和内标替米沙坦（Ⅱ）的典型MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms Amlodipine（Ⅰ）and internal standard Telmisartan（Ⅱ）

2.3 线性关系考察

以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W＝1/x2）最小二乘法进行回归，求得回归方程为：y＝0.017 1x＋0.000 376（r＝0.996 7），根据标准曲线，氨氯地平的线性范围为：0.100～20.000μg/L，定量下限为0.100μg/L。

2.4 准确度与精密度

方法学考察的低、中、高3个浓度分别为0.300、3.000、16.000μg/L，考察批次为3次，结果列于表2。结果表明，此方法的精密度和准确度偏差均在±15%以内。

表2 血浆中氨氯地平LC－MS/MS测定方法的准确度与精密度（n＝18）Table 2 Precision and accuracy of Amlodipine in human plasma by LC－MS/MS（n＝18）

2.5 提取回收率和基质效应

取空白血浆100μL，制备低、中、高3个浓度的质控样本 （浓度 分别为 0.300、3.000、16.000μg/L），每浓度3个样本。同时另取空白血浆100μL，经乙腈沉淀蛋白后，将上清液于40℃下氮气吹干，加入100μL蒸馏水，再加入相应浓度的标准溶液和内标，处理后进行LCMS/MS分析，获得相应峰面积，以每一浓度两种处理方法测得峰面积比值，计算提取回收率，氨氯地平低、中、高3个浓度提取回收率分别为（97.84±6.15）%、（97.77±4.56）%、（94.90±2.90）%，内标替米沙坦提取回收率为（88.96±1.82）%。以蒸馏水代替空白血浆，进行上述相应操作制备基质效应考察样本。以每一浓度两种处理方法测得的浓度比值计算基质效应，氨氯地平的基质效应为（－28.56±3.81）%，内标替米沙坦的基质效应为（8.63±1.61）%。结果显示：血样中氨氯地平和内标替米沙坦提取回收率均较高且稳定，血样中基质对内标替米沙坦的基质效应较小，氨氯地平基质效应为（－28.56±3.81）%，基质效应比较稳定，因此，均不影响准确测定。

2.6 稳定性考察

分别在－20℃反复冻融3次、－20℃下冻存60d、进样器放置14h（每批次每浓度各3样本），3种条件下考察方法的稳定性，结果列于表3。结果表明氨氯地平在这3种条件下的稳定性良好。

表3 氨氯地平LC－MS/MS测定方法的3种稳定性考察结果（n＝3）Table 3 Results of stabilities of Amlodipine in human plasma by LC－MS/MS（n＝3）

2.7 方法学应用

22名健康受试者，口服2片苯磺酸氨氯地平片（含苯磺酸氨氯地平10mg），平均血药浓度－时间曲线示于图3。

3 讨 论

氨氯地平是弱碱性化合物，实验中发现它在碱性和中性流动相中柱保留能力较强，在酸性流动相中易被流脱下来，为提高信噪比和定量限，本实验设计了甲醇－1mM乙酸铵水溶液－1mM乙酸铵（0.1%甲酸）水溶液三相梯度洗脱，通过1mM乙酸铵水溶液使氨氯地平在色谱柱上进行有效的保留和富集，再通过含酸的高比例甲醇溶液达到快速和完全的洗脱。实验之初设置的是等度洗脱方法，但之后空白血浆加药样本发现较严重的前沿基质抑制现象，故改为梯度洗脱的方式。在系统优化的基础上，最终确立了一个分析时间为5.5min的方法，使氨氯地平和内标均获得满意的响应、峰形和保留时间。

图3 22名健康受试者口服10mg苯磺酸氨氯地平后平均血药浓度－时间曲线Fig.3 Mean plasma concentration versus time rofile of amlodipine in 22healthy volunteers after oral administration of 10mg amlodipine besylate

常用的样品前处理方法有液－液萃取法、固相萃取法和沉淀蛋白法等，为了提高氨氯地平检测的灵敏度，文献多采用液－液萃取法[3－9]，由于氨氯地平结构中的二氢吡啶环为碱性含氮杂环，血样先碱化使氨氯地平游离后再用有机试剂提取，可提高提取回收率，但碱化试剂的碱性不能太强，否则易使结构中的羧酸酯发生碱水解反应。由于该检测方法有效地提高了信噪比，使化合物和内标均可与前沿基质峰完全分离，因此，本实验的样本前处理采用了快速的一步沉淀蛋白法，就达到了0.100μg/L的定量灵敏度，既满足了血浆中微量氨氯地平浓度测定的要求，又节省了大量的样本前处理时间，适用于氨氯地平的药动学和生物等效性研究。

此外，二氢吡啶类药物对光不稳定，所以实验过程中要注意严格避光，操作过程中用棕色容器，同时样品配制过程和分析过程要快速，尽量缩短整个分析时间，从而提高分析结果的可靠性。

本研究所建立的检测方法前处理过程简单，分析时间短，灵敏度高、专属性强，可用于氨氯地平人体药物动力学实验。

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