蓝莓汁生产热烫工艺对多酚氧化酶及多酚类化合物的影响

杨秀松

（国家食品药品监督管理局 高级研修学院，北京 100073）

蓝莓属于浆果类，营养丰富，其果实除含有糖、酸和Vc外，还富含维生素E、胡萝卜素、以及丰富的K、Fe、Zn、Mn等微量元素。据测定，每100g蓝莓含蛋白质0.5g，脂肪0.1g，碳水化合物12.9g，Ca 8mg，Fe0.2mg，P9mg，K70mg，Na1mg，Zn0.26mg，Se 0.1mg，胡萝卜素9mg，Vc 9mg，VE 1.7mg。除营养成分外，蓝莓果实中还含有大量以花色甙为主的植物化学物质，具有较强的抗氧化能力。野生种花色甙色素含量高达0.33～3.38g/100g鲜果，栽培种一般为0.07～0.15g/100g鲜果。

蓝莓果实含有大量的多酚氧化酶（PPO），在蓝莓加工过程中多酚氧化酶与花色苷及其它酚类物质充分接触，催化酚类物质发生氧化反应，导致果汁褐变。热处理可钝化PPO，防止褐变的发生，工业上常采用沸水热烫或蒸汽热烫。但蓝莓属于浆果，沸水热烫造成营养成分及功能成分的流失。采用蒸汽热烫，降低热处理造成的抗氧化成分的损失。本文研究了热烫条件对多酚氧化酶灭活的效果以及探讨了热烫条件对果汁抗氧化能力的影响，主要是针对蓝莓汁清除超氧阴离子和羟自由基的能力。

1 材料与试剂

1.1 材料和试剂

蓝莓：野生蓝莓，产自大兴安岭。蓝莓汁的提取是将野生蓝莓经蒸汽热烫、打浆、离心得到的上清液。1.7mg·mL-1LDL（协和生化所）。除三羟甲基氨基甲烷（Tris）为进口分装外，其余试剂均为国产分析纯或国产生化试剂。配制用水均为二次蒸镏水。

1.2 仪器和设备

热电偶数字显示巡回检测仪型号XMD（上海自动化仪表六厂）；UV2754型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；UVIKONXL紫外分光光度计（法国SECOMAM）；超级恒温水浴（上海市实验仪厂）；AE-4650电泳槽（ATTO公司）；AE-8150电泳电压装置（ATTO公司）。

2 实验方法

2.1 多酚氧化酶（PPO）的提取及酶活力的测定

将蓝莓按1∶2的料液比加入冷冻至-25℃的丙酮打浆，迅速抽滤，残渣用冷风吹干至无丙酮味，即得丙酮粉。丙酮粉用pH值为7.4的0.10mol·L-1的磷酸盐缓冲液提取，冷冻离心得粗酶液。

比色皿中加入2mL pH值为4.0的NaAc缓冲液、0.01 mol·L-1的绿原酸溶液0.7mL以及0.3mL粗酶提取液，在400nm下测吸光值随时间的变化。以每毫升粗酶反应液在前2min内吸光值随时间的变化情况计为酶活单位（吸光值·（mL·min）-1）。多酚氧化酶酶活的计算公式：

式中 M：每秒钟增加的吸光值；V：粗酶液的体积mL。

2.2 超氧阴离子清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化速率测定法测定，原理为邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化、释放出超氧阴离子，生成有色的中间产物，可用分光光度法进行测定。中间产物在320nm有强烈光吸收，当有抗氧化物存在时，可清除超氧阴离子，所以可以通过测定吸光度来计算清除率从而判断其抗氧化性。

采用邻苯三酚自氧化速率测定法，25℃下，在4.0mLTris-HCL溶液（pH=8.2）加入 1.0mL的 3mmol·L-1的邻苯三酚溶液，迅速混匀，测定样品管时加入1.0mL的蓝莓汁，测定基底管时不加样品而用Tris-HCL溶液定容为6mL，然后倒入石英比色杯内，在320nm波长光线下，每隔30s测吸光值A一次，得到实验数据。

按下式计算蓝莓汁对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率（S%）

式中 A空：空白试管中溶液吸光度值；A底：只有基底的试管中溶液吸光度值；A样：加入样品的试管中溶液吸光度值。

2.3 羟自由基清除能力的测定

清除羟自由基实验的原理为：Fe2＋-EDTA、抗坏血酸及过H2O产生·OH使脱氧核糖降解，在酸性环境中，降解产物可与TBA反应，形成粉红色物质，可用比色法测知脱氧核糖的降解情况，了解受试物是否具有清除·OH的能力。

实验过程：取干净的10mL硬质管，加入PBS缓冲液（KH2PO4-K2HPO4pH=7.4）0.4mL，再加入 0.1mL的样品液（包括 1.04mmol·L-1EDTA-1mmol·L-1Fe-SO41mmol·L-1Vc）和 12mmol·L-1H2O20.1mL，再加入 60mmoL·L-1DR（脱氧核糖）0.05mL，然后用 PBS缓冲液定容为1.0mL。将管中液体混合均匀后置于37℃的恒温水浴锅中保持1h。水浴完毕取出，迅速添加1mL 10%TCA（三氯乙酸）及1mL 1%TBA（硫代巴比妥酸），在100℃沸水中加热15min取出，冷却。于532nm处测吸光值，得到实验数据。

按下式计算蓝莓汁对羟自由基（OH·）的清除率（S%）

式中 A模型：模型管吸光度（不加样品）；ADR：加入清除剂和DR后的吸光度；A样品：样品本身的吸光度（不加DR）。

3 实验结果

统计学处理数据用均数±标准差（X±S）表示，采用SAS9.0软件包对各组数据进行方差分析。

3.1 热烫对多酚氧化酶（PPO）活性的影响

热烫的主要目的是使蓝莓的内源性多酚氧化酶失活，防止果汁发生酶促褐变，因而热烫要使蓝莓的中心温度达到一定值才能保证蓝莓的PPO完全失活。通入蒸汽时间越长，中心温度越高，酶的失活越彻底，但活性成分的损失也越严重，因此，本试验设计了笼屉式与堆放式两种热烫方式，比较蒸汽通入时间对多酚氧化酶和抗氧化成分的影响。

设定的蒸汽通入时间为 1、2、3、4min，并以未通入蒸汽为对照。测定加入蓝莓粗酶后20、40、60、80、100、120s绿原酸溶液光密度的变化，计算多酚氧化酶的活性。两种热烫方式在不同蒸汽通入时间下多酚氧化酶的活性见图1、2。

图1 笼屉式热烫蒸汽通入时间对多酚氧化酶的灭活作用Fig.1 Effect of steaming time of streaming heating on deactivation to polyphenoloxidase

图2 堆放式热烫蒸汽通入时间对多酚氧化酶的灭活作用Fig.2 Effect of steaming time of stack heating on deactivation to polyphenoloxidase

由图1、2可见，笼屉式热烫可在2min达到对多酚氧化酶的灭活作用，堆放式热烫则需要4min才能钝化多酚氧化酶。结果表明，笼屉式热烫效果好于堆放式。这和堆放式物料体积较大，中心温度上升较慢有关。

3.2 热烫对蓝莓汁抗氧化能力的影响

超氧阴离子自由基（O2-·）是体内造成机体氧化损伤最主要的自由基，可造成蛋白质和脂质的过氧化损伤，清除超氧阴离子自由基（O2-·）的能力可反映体系的抗氧化损伤的能力。为此，分别将蒸汽通入时间为1、2、3、4min制备的蓝莓汁1mL加入反应体系，测定其对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力，结果见图3。

图3 蒸汽通入时间对蓝莓汁超氧阴离子自由基清除能力的影响Tab.3 Effect of steaming time on clean of free radical of superoxide anion

羟自由基是另一种主要自由基，对DNA的损伤作用较强。分别将蒸汽通入时间为1、2、3、4min制备的蓝莓汁0.1mL加入反应体系，测定其对羟自由基（OH·）的清除能力，结果见图4。

图4 蒸汽通入时间对果汁羟自由基清除能力的影响Tab.4 Effect of steaming time on clean of hydroxy radical

由图3、4可见，两种热烫方式下，随蒸汽通入时间的延长，果汁对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除能力均呈下降趋势，其中笼屉式热烫对自由基的清除能力的影响更大、衰减更快。但从笼屉式的灭酶时间2min和堆放式的灭酶时间4min看，笼屉式热烫保留的抗氧化成分要多一些。上述结果表明，笼屉式热烫比堆放式适合蓝莓汁的制备。

4 结论

多酚氧化酶是一类以Cu2+为辅基的氧化还原酶，通过分子氧催化酚类物质氧化得到醌，随后发生醌聚合而产生褐变反应。同时影响产品多酚的含量和抗氧化活性。通过加热的方式可以灭活多酚氧化酶，防止果汁褐变。但同时加热也可以造成多酚物质的氧化，使其抗氧化活性降低。因此抑制多酚氧化酶、保存多酚的抗氧化活性是蓝莓果汁制备的关键质量控制目标之一。

酶与多酚的失活和加热温度、加热时间呈正相关，因此，加快到达中心温度的时间、减少温度的维持时间，既可使多酚氧化酶失活，又可以尽可能地保留多酚的抗氧化活性。为此，本文设计了笼屉式加热与堆放式加热两种热处理方式，结果表明笼屉式热烫处理好于堆放式热烫。笼屉式热烫2min可达到灭活多酚氧化酶的效果，同时可保留较多的多酚类抗氧化成分。这是因为笼屉式热烫操作过程中物料厚度小，到达中心温度的时间快，因而通入蒸汽2min即可起到灭酶作用，比堆放式到达灭酶时间（4min）短，因而多酚破坏少。

［1］杨丽勇.蓝莓的营养保健功能及其产品开发［J］.中国食物与营养，2007，（4）:24-25.

［2］李亚东，张志东，吴林.蓝莓果实的成分及保健机能［J］.资源与生产,2002，（1）:27-28.

［3］李颖畅，孟宪军.蓝莓花色苷抗氧化活性的研究［J］.食品与发酵工业，2007，（9）：61-64.

［4］刘玉田，赵玉平，邹琴.蓝莓干红的抗氧化能力分析［J］.酿酒，2008，（1）：98-100.

［5］刘淑兰，吕秀莲，王晓军，等，越橘的化学成分与药理活性研究进展［J］.中医药学报，2006，（6）：53-54.

［6］盛洁.神奇果——蓝莓［J］.医药养生保健报，2008，（2）：18.

［7］罗建光，杨晓彤，杨庆尧.大型药用真菌降血脂作用研究进展［J］.时珍国医国药，2006，（11）：2296-2298.

［8］Simonian NA,Coyle JT.Oxidative stress in neurodegenerative disease［J］.Annu.Rev.Pharmacol Toxicol,1993,36:83-106.

［9］Ross R.The pathogenesis of ather osclerosis a perspective for the 1990s［J］.Nature,1993,362:801-809.

［10］Berliner JA,Heinecke JW.The role of oxidized lipoprotein in atherogenesis［J］.Free Radic Biol.Med.，1996，（5）:707-727.

［11］Chen,K,Thomas,S.R.,Keaney,J.F.Beyond LDL oxidation:ROS in vascular signal transduction［J］.Free Radical Biology Medicin,2003,35（2）：117-123.

［12］Kwak BR,Mulhaupt F.Ather osclerosis:anti-inflammatory and immunomodulatory activities ofstatins［J］.Autoimmun Rev.,2003,（2）:332-338.

［13］Kuo C,Campbell LA.Detection of Chlamydia pneumoniae in arterial tissues［J］.J.Infect Dis,2000,181（3）:432-436.

［14］LibbyP,TanakaH.The molecula bases of restenosis［J］.Progcadiovase Dis.，1997,40（2）:97.

［15］Celmaje DS.Endothelial dysfunction dose is matter Is it reversibly［J］.AmColl Cardiol,1997,30:325.

［16］Danesh J,Wheeler JG,Hirschfield GM,et al.C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary herartdisease［J］.N.Engl.J.Med.，2004,350:1387-1397.