纳米粒的主动靶向修饰在肿瘤治疗中的研究进展

何玉芳，范 青

(大连医科大学 附属第二医院 药剂科，辽宁 大连 116027)

随着纳米粒制备技术的发展，其在抗肿瘤中的研究也越来越广泛。纳米粒在抗肿瘤中的优势主要如下：(1)靶向作用，纳米粒本身具有一定的被动靶向作用，因为在正常组织的血管中，两个内壁细胞之间的距离约为2 nm，而在肿瘤血管中，两个内壁细胞之间的距离为100～150 nm，这就导致了肿瘤组织的“高通透性与滞留”效应(EPR-effect)，抗肿瘤纳米粒的粒径一般为10～150 nm，具有超强的渗透力，可以渗透入肿瘤组织中并蓄积，对于肿瘤多药耐药(multidrug resistance， MDR)有一定的意义，这是纳米粒在抗肿瘤中最突出的优势；(2)采用具有生物适应性及可生物降解的材料作为载体，如聚乙丙交酯(PLGA)、壳聚糖、脑磷脂等，进入体内后不会引起机体免疫反应并且能生物降解，对人体的毒副作用很低；(3)可控制药物的释放，这跟粒径也有一定关系，粒径较小的纳米粒，释放较快，粒径较大的则释放较慢[1]；(4)增加难溶性药物的溶解度，提高生物利用度；(5)可改变药物的药代动力学特性，延长某些药物的半衰期；(6)表面积大，因而载药量较高。

然而纳米粒仍然有些缺陷，它易被网状内皮系统(RES)吞噬，在还没达到靶向部位时，就在RES分布较广的肝、脾等器官蓄积，半衰期较短，所以需要对纳米粒进行适当的修饰，以避免RES的吞噬作用。

肿瘤组织与正常组织的生理、物理状态有很大差异，根据这些差异对纳米粒载体材料或其表面进行适当修饰可以将其制成主动靶向纳米粒，直接靶向肿瘤组织，减小对正常组织的损伤。目前应用较多的有如下几类。

1 受体介导类

这类受体都是天然受体，因为肿瘤细胞不断增殖，需要补充大量促进生长的物质，如维生素、铁离子等，此外肿瘤组织的转移、血管增生等也会上调相关受体的表达水平，配体与受体的结合有着高度特异性与亲和力。纳米粒通过受体介导的内吞作用进入细胞。

1.1 叶酸(folic acid，FA)

叶酸对细胞的分裂、增殖，以及某些生物大分子的合成、代谢有着重要的作用。肿瘤细胞不断增殖，需要大量叶酸，在肿瘤组织尤其是子宫、乳腺、脑、肺、肾癌细胞中会高表达叶酸受体(Folate receptor，FR)[2]，而在正常组织中低表达或不表达。并且在癌细胞中表达的叶酸受体多为α-FR，对游离的叶酸具有很强的亲和力，叶酸与大分子物质共价结合后，仍然可以像游离的叶酸一样与肿瘤细胞中的叶酸受体紧密结合；而在正常细胞中表达的多为β-FR[3]，该受体优先与5-甲基四氢叶酸结合，因此将叶酸偶联到纳米粒中可产生主动靶向作用。另一方面，叶酸无毒，分子量低，具有较低的免疫原性，价格便宜，所以叶酸是一种比较理想配基。

Ulbrich K等[3]制备了叶酸-人血清白蛋白纳米粒(HAS-NPs)，体外实验将该纳米粒作用于人成神经细胞瘤UKF-NB-3，大鼠恶性胶质瘤101/8以及人包皮成纤维细胞HFFs中，结果显示未经FA修饰的HAS-NPs在三种细胞中的摄入无明显差异，而经FA修饰后的FA-HAS-NPs在肿瘤细胞UKF-NB-3与101/8中的摄入增多而在正常细胞HFFs中的摄入减少，体现了叶酸对肿瘤细胞的选择性。而Zhang ZW等[4]通过谷胱甘肽(GSH)将FA与金-纳米粒(GNPs)偶联，制备的FA-GSH-GNPs粒径为(36.4±4.2) nm，在FR高表达的Hela细胞中摄入较高，而在FR水平较低的A549细胞中摄入较低，这说明叶酸对肿瘤的选择性不只存在于肿瘤与正常组织之间，对于不同的肿瘤，叶酸也有一定的选择性。

1.2 黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)

黄素单核苷酸的原型为核黄素(Riboflavin，Rf)，即维生素B2，对于细胞的新陈代谢有着重要的作用。在新陈代谢旺盛的细胞如肿瘤、激活状态的内皮细胞中会高表达核黄素载体蛋白(Riboflavin carrier protein，RCP)，能与Rf结合，并将其转移至细胞内。此外，FMN发出的绿色荧光，可以赋予纳米粒标记肿瘤的作用。

Jayapaul J等[5]用FMN包裹超微型超顺磁性氧化铁(USPIO)核制备的纳米粒(FLUSPIO)，体外实验通过透射电镜、质谱显示在人前列腺癌细胞PC3与人脐静脉内皮细胞HUVEC中FLUSPIO的摄入明显高于USPIO，并且细胞在经过FLUSPIO孵育30 min和1 h后，R2弛豫率明显高于经过USPIO孵育的效果。

1.3 转铁蛋白(transferrin，Tf)

转铁蛋白对于维持体内铁离子的平衡至关重要，去铁转铁蛋白(Apotransferrin)与铁离子结合后形成Tf，然后与转铁蛋白受体(TfR)结合，通过内吞作用进入细胞[6]。TfR在多种肿瘤细胞高表达，如膀胱癌过渡细胞、乳腺癌、神经胶质瘤、肺腺癌、慢性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤等[7]。此外，Tf本身也可作为纳米粒的载体。Wang J等[8]将Tf的抗体OKT9与PRINT®nanoparticles结合，以IgG1-PRINT®为对照组，作用于4类细胞中，其TfR表达水平如下Ramos > HeLa ≈ H460 > HEK293，经检测胞内纳米粒浓度，发现在实验组中，其胞内浓度高低与TfR的表达水平高低一致，而在对照组则没有这一趋势。 Hong MH等[9]制备了Tf-PEG-NPs作为羟基喜树碱的载体，组织分布实验将各组药物分别作用于TfR高表达的S180肉瘤移植小鼠，结果Tf-PEG-NPs在肿瘤组织中的浓度是最高的，是PEG-NPs的2.47倍。这说明不论是TfR的抗体还是Tf，都具有对肿瘤的靶向性。

1.4 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)

表皮生长因子能强烈刺激上皮细胞的生长，对于肿瘤的发生亦有促进作用。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)能与EGF、转化生长因子等多种配基特异性结合，在正常组织中也有表达，但在肿瘤组织中的表达远远高于正常组织，主要存在于乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌以及神经纤维瘤的细胞中[10]，尤其是发生转移或产生多药耐药的肿瘤细胞。EGFR的异常会对细胞产生误导作用，导致细胞不停生长。将EGF对纳米粒进行修饰同样可以赋予其主动靶向性。目前利用EGFR产生主动靶向的方式有很多，如EGFR抗体、EGFR肽等。

Milane L等[11]制备了氯尼达明(LON)与紫杉醇(PTX)的载药纳米粒PLGA-PEG-EGFR肽-NPs，得到主动靶向纳米粒。经小鼠尾静脉注射后测定各药代动力学参数，PTX溶液组在肿瘤中的半衰期T1/2为(1.31±1.00) h，被动靶向NPs将其延长至(5.92±2.49) h，而主动靶向NPs则延长至(8.24±2.16) h；LON溶液组与纳米粒组分别在给药1 h和3 h后达到肿瘤组织中的Cmax，其中LON溶液组Cmax为(1.15±0.99) μg/mL，被动靶向NPs为(5.68±1.30) μg/mL；主动靶向NPs为(7.38±1.84) μg/mL。说明经过EGFR肽修饰后化疗药物具有更好的药代动力学特性。Sandoval MA[12]将EGF与硬脂酰-吉西他滨-纳米粒(GemC18-NPs)共价结合，以白蛋白(OVA)-GemC18-NPs为对照组。体外实验结果发现EGFR受体表达水平依次增高的细胞，其细胞摄入也依次增高。在小鼠肿瘤模型中，EGF-NPs在肿瘤组织中的蓄积比OVA-NPs高了2倍，对肿瘤有着较强的选择性。因此，无论是从药代动力学还是对肿瘤靶向性的角度来看，EGFR都有一定优势。

2 多肽类

此类多为人工合成多肽，这些多肽可与特定受体的某个结合域结合，或者干扰配体与受体的结合，也有较强的亲和力。

2.1 RGD肽

肿瘤增殖的同时，会生成大量新的血管，为其输送养料。整联蛋白αvβ3是细胞的一种黏附分子，在多种肿瘤细胞中高表达，对肿瘤新生血管与转移有着举足轻重的作用。整联蛋白αvβ3中有一个RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)结合域，可与RGD肽稳定结合[13-14]，用RGD肽制备纳米粒，可靶向肿瘤血管内皮细胞。

Danhier F等[14]用RGD修饰了包裹抗肿瘤药JNJ-7706621的纳米粒，体内实验中， JNJ-7706621溶液组处理的肝移植瘤小鼠平均生存期为9.8 d，被动组为15.3 d，RGD-NPs组延长为16.8 d，且差异具有统计学意义。说明纳米粒尤其是RGD-NPs能明显延缓肿瘤的生长。

2.2 K237肽

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与细胞的迁移、入侵、血管形成及血管通透性有关，在肿瘤新生血管的内皮细胞高表达，而在其邻近的正常组织几乎不表达[15]。VEGF主要有四类受体：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flt-1)、NRP-1 和 NRP-2。其中已确定KDR/Flt-1在肿瘤血管形成中发挥了主要的调节作用，VEGF与KDR结合后，能刺激血管内皮细胞增殖。K237肽是从噬菌体中分离出来的小分子多肽，与KDR有着高度的亲和力，可以干扰VEGF-KDR的结合。另外，K237肽对移植的实体瘤有着明显的抑制作用。

Yu DH等[16]制备了K237-PTX-NPs，体内实验给MDA-MB-231乳腺癌移植瘤裸鼠注射荧光标记的NPs，2 h后，该纳米粒到达肿瘤血管，相反，不含K237的NPs并没有到达肿瘤血管，而是渗透到了肿瘤的软组织中。因此K237对于肿瘤血管的靶向有着一定的引导作用。

2.3 YIGSR 肽

层粘连蛋白受体(laminin receptor)在肺癌转移性细胞中高表达，而YIGSR肽可以特异性结合该受体， Sarfati G等[17]将YIGSR肽通过羧基团与聚合物纳米粒表面结合，制备了靶向肺癌转移细胞的纳米粒。体内实验证明该纳米粒在肺正常组织中的蓄积量与其他肽修饰的纳米粒无明显差别，而在肺转移细胞中的蓄积量比其他肽高5倍，并且没有心脏、肝、肺的趋向性。

3 黏多糖类

某些糖类的受体在肿瘤细胞的表达水平高于正常细胞，所以糖类也具有肿瘤靶向性。糖类包括单糖和多糖，其中常用于靶向修饰的单糖有乳糖、甘露醇等；多糖多为黏多糖，如肝磷脂、透明质酸等，主要与肿瘤细胞的迁移有关。

3.1 肝磷脂(heparin，HeP)

肝磷脂也叫肝素，是由重复的硫基化二糖单位组成的负电荷线型黏多糖，具有抗凝集、抗炎、抗血管再生、抗肿瘤增殖等作用，并且肝素与不同转录因子作用后会产生促凋亡的活性。转移性的癌细胞会高表达肝素酶与类肝素酶，使肝磷脂降解，以便于细胞的迁移[18-19]。

Lee K等[18]用荧光染料标记肝磷脂用于修饰金-纳米粒的表层，体外实验用转移性高的宫颈癌细胞Hela、转移性低的乳腺癌细胞MCF-7以及非肿瘤细胞系NIH3T3，RT-PCR检测三者的类肝素酶水平依次降低，经过荧光分光光度计检测，细胞内荧光强度也依次降低，说明肝素对转移性的肿瘤细胞有更强的靶向性。

3.2 透明质酸(hyaluronic acid，HA)

透明质酸也叫玻尿酸，其在纳米粒中的应用主要在于他可以结合CD44，而CD44的表达与肿瘤的迁移有着显著的相关性，用HA对纳米粒表面进行修饰，不仅可以产生靶向作用，还可使癌细胞对抗肿瘤药物更敏感。

Cho HJ等[20]将HA与神经酰胺(CE)结合，并加入普朗尼克F85，与其他共聚物制备了多西他赛载药纳米粒，体外实验将香豆素-6标记的纳粒作用于CD44表达较低的U87-MG细胞和CD44表达较高的MCF-7细胞，在激光共聚焦显微镜下观察，发现在MCF-7细胞内，其荧光强度明显强于U87-MG，而用游离HA干扰后，MCF-7内荧光强度明显减弱，导致这一结果的原因无疑是HA与CD44的结合作用。

4 抗体类

抗体介导类主要依靠抗原抗体的特异性结合，将纳米粒靶向特定组织，肿瘤抗体是近年来的一个研究热点，靶向制剂也随之掀起了抗体靶向的潮流。

4.1 单链抗体片段(ScFvs)

单链抗体片段在抗肿瘤纳米粒中的应用也比较广泛，他的优势在于：(1)分子量小，其大小只有IgG抗体的1/5，但却保留了充分的抗原结合能力，所以即便与纳米粒结合，也能使其保持在较小的粒径范围内；(2)不含Fc连续片段，所以不足以产生有害的免疫反应；(3)容易获得。Vigor KL等[21]用癌胚抗原(CEA)的特异性scFv修饰SPION-NPs，将该纳米粒与被动组作用于CEA阳性表达的结肠癌细胞LS174T与CEA阴性的黑色素瘤细胞A375M，激光共聚焦显微镜下观察，scFv-SPION-NPs能特异性靶向CEA阳性细胞。通过MRI测定了T2弛豫率的减少百分率，CEA阳性细胞明显大于CEA阴性细胞，进一步证明了scFv对CEA的特异性。

4.2 AMG 655

AMG 655是死亡受体(death receptor，DR5)的单克隆抗体，DR5是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，在结肠、胰腺癌中高表达，在正常组织中低表达或不表达。AMG 655与DR5结合后会促使表面高表达DR5的细胞凋亡，其机制主要是通过激活caspase 8通路来实现。Fay F等[22]用人工合成单克隆抗体AMG-655修饰载药纳米粒表层，并用香豆素-6对其进行荧光标记，作用于DR5高表达的结肠癌细胞HCT116，在荧光显微镜下观察，AMG-655-NPs组荧光强度明显大于被动组，并且强于同型抗体结合的纳米粒组，而加入游离的AMG-655之后，荧光强度明显减弱，说明细胞对纳米粒的摄入跟AMG-655与DR5的结合相关。

5 展 望

纳米粒经过修饰之后会变得更智能，近年来有众多学者将不同的主动靶向修饰方法相结合，大大改善了纳米粒的靶向性，尤其治疗与诊断相结合的纳米粒让肿瘤治疗迈进了新的时代。纳米粒的实验室制备技术已经发展的相当成熟，但是仍然还有许多问题亟待解决，比如正常组织中也存在靶点受体，会对正常组织产生损伤；配体的偶联度不能达到靶向要求等。目前纳米粒大多处于临床前研究阶段，因此，如何将抗肿瘤纳米粒推向临床是一个迫切而又慎重的问题。

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