原核表达PRRSV结构蛋白构建活载体疫苗的研究进展

韦志强

（四川省成都市温江区农村发展局，四川 成都 611130）

1 免疫预防现状

目前在生产上应用的主要是商品化弱毒苗，几种商品化弱毒苗在减少PRRS疾病损失方面发挥了一定的作用，但PRRS疫苗的使用仍然存在着不少问题:（1）疫苗毒能在猪体内持续性存在，能从免疫猪传给非免疫猪，从免疫猪群传到非免疫猪群，公猪免疫后可通过精液传播，母猪免疫后可经胎盘造成胎儿的先天性感染；（2）血清型不同时，保护作用不完全，且持续时间较短，对于新出现的超强毒株则完全无保护作用；（3）疫苗免疫后并不能明显减少强毒株在猪群内的传播；（4）疫苗毒能返强而致病，免疫后抗体水平低下时，有诱发ADE作用的可能，反而使病情加剧。因此，对于PRRS弱毒疫苗应采取谨慎使用的态度，研制高效安全的疫苗乃当务之急。

2 PRRSV结构蛋白及活载体疫苗开发

随着新型疫苗的不断涌现，PRRS活载体疫苗也逐渐成为国内外研究的热点。活载体疫苗主要针对PRRSV的三种主要结构蛋白:GP5/E蛋白（囊膜糖蛋白）、ORF6编码膜基质蛋白（M蛋白）及OFR7编码核衣壳蛋白（N蛋白）。

2.1 GP5/E蛋白 PRRSV E基因长603 bp左右，编码GP5糖基化包膜蛋白（又称E蛋白），在所有结构蛋白中是变异程度最高的一种蛋白，但GP5是重要的抗原保护性蛋白，能诱导高滴度的中和性抗体，具有最强的中和能力，在保护性免疫应答中发挥重要作用。Rodrigue等研究缺失跨膜区的GP5基因在大肠杆菌中获得良好的表达，且表达产物可与PRRS阳性血清发生阳性反应。Gonin等将PRRSV-GP5克隆到融合有GST蛋白基因的pGEx-4T-1载体中，结果其表达产物可用于病毒血清学检测。谷红等将中国分离的BJ-4株缺失N端疏水序列的PRRSV-dGP5克隆到原核高效表达载体pGEX-4T-2中，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dGP5，表达产物以包涵体形式存在，表达量为20.8%，利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白。陈建君等将中国GD株GP5克隆到原核表达载体pBAD/g III C中，将该片段定向插入到转化大肠埃希氏菌中，重组质粒用阿拉伯糖诱导表达，用Western blotting鉴定表达蛋白，结果证明GP5基因得到表达。目前国内外学者虽然已对E蛋白的本质及其原核表达、免疫反应特征、在保护性免疫中的作用等方面进行了大量的研究工作，并取得了较大的进展，但仍有很多方面尚不十分明确。

2.2 ORF6编码的非糖基化蛋白（M蛋白） ORF6基因长525bp左右，编码M蛋白，具有高度保守性。在所有蛋白中M蛋白刺激引起的T细胞增殖反应最为强烈，可见M蛋白与PRRSV诱导的细胞免疫有关。另外，M蛋白上至少存在4个线性抗原表位和3个构象性表位，能诱导低滴度的中和抗体产生，这对PRRSV基因工程疫苗的设计具有重要的指导意义。王娇等采用原核表达载体pET-32a（+）表达了河北地方珠PRRSV-ORF6蛋白，经Western-blotting分析表明，表达蛋白与阳性血清发生了特异性反应。综合这些研究结果，一方面可以利用该原核表达产物建立反映机体抗体水平的特异性诊断方法；另一方面，该特异性抗体的制备对以M蛋白为基础的PRRSV新型基因工程疫苗的研制以及对疫苗激发免疫反应的检测提供了基础材料。

2.3 ORF7编码核衣壳蛋白（N蛋白） N基因及其编码蛋白长372bp左右，主要编码核衣壳蛋白，是一种碱性磷酸蛋白，N蛋白和M蛋白一样具有高度保守性，N蛋白的抗原位点分散于整个N蛋白上，没有一个N蛋白氨基酸片段能模拟完整N蛋白的抗原性，且美洲型毒株和欧洲型毒株的N蛋白上存在着能发生交叉反应的保守性抗原位点，同时也存在着不同反应性的特异性抗原表位，这些针对共同抗原表位的特异性单抗，对于PRRSV的诊断以及鉴别美洲型和欧洲型PRRSV感染均具有重要意义。与其他蛋白相比，N蛋白激发的体液免疫反应最强，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。另外，猪感染PRRSV后，针对各种结构蛋白的抗体成分的出现时间不同，而N蛋白抗体出现较早，最早于感染后一周即可检出N蛋白抗体，且N蛋白抗体维持时间较长，其下降速度也明显慢于M和GP5抗体。因此，N蛋白可作为诊断抗原用于PRRS的抗体检测。国内外学者利用此原理对ORF7基因进行了原核高效表达，以达到诊断应用的要求。夏平安等将N蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中，构建了重组表达质粒pET-N，用Western blotting分析纯化后的融合蛋白，结果显示出良好的生物学活性；再利用纯化融合蛋白作包被抗原，同时优化ELISA反应条件，建立了可检测抗PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法（N-ELISA），并将所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA同时对200份临床送检血清进行平行检测，结果阳性符合率为92.7%，表明本试验建立的N-ELISA与IDEXX-ELISA具有同样高的特异性。

3 结语

目前国内外的研究显示原核表达系统能高效表达PRRSV的主要结构蛋白，并经体外试验检测，所表达的蛋白抗原具有很好的免疫原性，这对开发研制新型的高效免疫疫苗及诊断方法具有重要意义。

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