雷公藤多甙对体外培养的人翼状胬肉上皮鳞状化生的影响△

吴 恺 刘二华 谭 钢 邵 毅

上皮鳞状化生是非角化的复层扁平上皮向角质化复层上皮转化的一种特殊的病理过程［1-3］。角膜和结膜上皮鳞状化生非常多见，如干眼、干燥综合征、眼类天疱疮、眼化学性烧伤、翼状胬肉、睑裂斑和维生素A缺乏症等［4］，它常常导致视功能的严重丧失，是眼部致盲的主要原因之一。目前国内外已有人研究发现翼状胬肉本身就是一种上皮鳞状化生的重要模型。雷公藤多甙是一种雷公藤提取物，具有较强的免疫抑制作用，现已广泛应用于临床。至今为止，国内外尚未见雷公藤多甙对上皮鳞状化生作用的相关研究报道，本研究通过体外培养基浸没培养人翼状胬肉组织构建上皮鳞状化生，探讨雷公藤多甙对上皮鳞状化生的抑制作用及进一步阐述其可能相关机制。

1 材料与方法

1.1 标本采集与处理 选择2010年1月至6月在本院就诊的原发性翼状胬肉住院患者16例(16眼)。翼状胬肉诊断标准:患者无外伤史，未做过翼状胬肉手术或常规药物治疗，翼状胬肉病变组织侵入角膜超过角巩膜缘3 mm以上或瘢痕组织严重增生影响美容及限制眼球运动。眼科检查排除慢性泪囊炎、沙眼、睑缘炎、过敏性结膜炎及其他眼表疾病的病例，所有病例无长期眼科用药史。所有翼状胬肉患者均由同一人行翼状胬肉切除术。具体方法如下:常规消毒，5 g·L-1的卡因表面麻醉，于翼状胬肉颈部即角结膜交界处注射适量的20 g·L-1利多卡因，显微镜下用剪刀分离翼状胬肉与周围正常角结膜后剪除翼状胬肉头部，清除变性的角膜和结膜下组织后，上下方结膜伤口边缘直接缝合8-0可吸收缝线1～2针。术毕结膜囊涂妥布霉系眼膏，术眼包扎。术后3 d每晨换药，予妥布霉素滴眼液滴术眼每日4次，妥布霉素眼膏涂眼每晚1次。术后7～10 d停药。术后的随访时间为1个月。记录所有患者的原始数据和随访数据。将术中剪除下来的翼状胬肉头部放于含体积分数5%FBS的DMEM培养基中，于30 min内送于实验室进行实验操作。

1.2 人翼状胬肉组织的体外培养 从翼状胬肉患者眼部取下胬肉头部组织，用含有50 g·L-1庆大霉素和1.25 g·L-1两性霉素B的DMEM培养基漂洗3次，每次2 min;解剖显微镜下用显微器械除去翼状胬肉下筋膜组织，并将含有完整上皮和基质的翼状胬肉组织头部剪成约2 mm×2 mm的组织小片;将上皮面朝上的翼状胬肉组织小片平铺于已准备好的嵌入物或培养皿的滤膜上中央部位。将上述铺有翼状胬肉组织的培养皿嵌入物置于24孔板培养皿中，向培养皿中加入SHEM培养基或浓度为100 μg·L-1雷公藤多甙SHEM培养基，并使翼状胬肉上皮浸没于培养液中;将上述翼状胬肉组织置于体积分数5%CO2培养箱(37℃，95%湿度)中培养，每2 d换液1次，翼状胬肉组织分别连续培养7 d和14 d。

1.3 实验分组 将翼状胬肉组织进行分组实验。对照组使用SHEM培养基Submerge培养法培养翼状胬肉组织，实验组在含100 μg·L-1雷公藤多甙的SHEM培养基中用Submerge培养法培养翼状胬肉组织。两组每个时间点各培养3个翼状胬肉组织小片。DAPI染色确定培养组织的上皮层数。

1.4 免疫荧光组织化学染色检测K14 将冰冻切片复温、晾干，置于-20℃丙酮中固定，体积分数1%PBS漂洗3遍，加20 g·L-1牛血清蛋白去除非特异性染色。滴加用10 g·L-1牛血清蛋白稀释的一抗(1∶200，购于美国Santa Cruz公司)，体积分数1%PBS漂洗3遍后，在避光条件下滴加以绿色荧光素标记的二抗。用DAPI(H-1200)封片，荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察结果，拍照。

1.5 免疫组织化学染色检测Pax6和Ki67 根据SABC免疫组织化学试剂盒说明书进行。将冰冻切片复温、晾干，置于-20℃丙酮中固定，体积分数1%PBS漂洗3遍，体积分数0.6%过氧化氢灭活细胞内源性过氧化物酶，血清封闭后，滴加一抗(1∶200，均购于美国 Santa Cruz公司)及二抗，DAB显色，封片。光学显微镜下观察，照相记录结果。

1.6 Western blot检验 实验标本收集后，称质量，碾碎后提取各组实验样本的总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，然后 Western blot印记杂交，转膜，Block Buffer溶液封闭，Block Buffer溶液以适当比例稀释一抗(Pax6、K14)，在塑封袋中孵育抗体，4℃过液。用TBST洗涤一抗，在侧摆摇床上快速摇动，洗涤3次，每次10 min。用Block Buffer溶液以适当比例稀释二抗，在侧摆摇床上，缓慢摇动，室温孵育60 min。用TBST洗涤二抗，在侧摆摇床上快速摇动，洗涤3次，每次10 min。利用增强的化学放射发光法，标记结合信号后进行显影。

1.7 图像分析 采用Nikon TE2000倒置荧光显微镜、FV1000激光扫描共聚焦显微镜、Nikon光学显微镜和Nikon NIS专业图像分析软件采集系统对各组翼状胬肉组织切片Pax6、Ki67和K14免疫荧光和免疫组织化学结果进行拍照，运用图像分析软件Image Pro Plus V6.0对翼状胬肉组织切片的免疫荧光和免疫组织化学结果进行分析，将彩色的荧光和组织化学图片还原成灰度图片后作黑白反相，作光密度矫正后在count/size中选择相应强度的阈值，测量阳性结果的光密度值(integrated optical density，IOD)，取其平均值。

1.8 统计学分析 采用随机对照方法，各组各时间点的实验均重复3次或以上，使用Windows XP操作系统下的统计分析软件Prism 4.0，实验数据IOD以±s表示，组间比较采用两独立样本的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学变化 对照组培养7 d后，翼状胬肉上皮层数增加，为(11.50±3.50)层，上皮变得不完整，形态由直线变成锯齿生长;实验组培养7 d后，翼状胬肉上皮层数未见明显增加，为(7.50±3.50)层，形态依然为直线状生长，两组上皮层数相比差异有统计学意义(t=1.778，P＜0.05)。14 d时，实验组上皮层数为(7.50±3.00)层，对照组为(13.00±4.00)层，两组比较差异仍有统计学意义(t=2.393，P＜0.05)。

2.2 Pax6的表达情况 对照组培养7 d后，Pax6几乎无表达，而实验组上皮层中可见有Pax6的表达。与培养前正常翼状胬肉组织(光密度值为6896.28±571.95)相比，实验组培养14 d后，Pax6在上皮细胞核中的表达未见明显变化(光密度值为6923.76±225.26)，而对照组Pax6的表达显著降低(光密度值为178.84±126.18)，两组比较差异有统计学意义(t=6.328，P＜0.05;图1-图2)。

2.3 Ki67的表达情况 与培养前正常翼状胬肉组织(光密度值为1034.78±599.17)相比，对照组Ki67在翼状胬肉上皮的表达稍有增强(光密度值为1752.26±536.29)，实验组Ki67在翼状胬肉上皮的表达明显减少(光密度值为261.23±113.27)，两组Ki67表达差异有统计学意义(t=4.486，P＜0.05;图3)。

Figure 1 Pax6 expressions in pterygium tissue after cultured 14 days.A:Normal pterygium tissue;B:Control group;C:Experiment group 翼状胬肉组织培养14 d后Pax6的表达情况。A:正常翼状胬肉组织;B:对照组;C:实验组

Figure 2 Western blot results showed the pterygium tissue after cultured 7 days and 14 days，Pax6 was expressed in epithelial layer in experiment group，but almost not in control group Western blot结果显示翼状胬肉组织体外培养7 d和14 d，实验组上皮层中可见有Pax6的表达，而对照组几乎无Pax6表达

2.4 K14的表达情况 对照组培养7 d后可见有K14的表达，而实验组上皮层中无K14表达。培养14 d后，实验组K14在上皮细胞核中无表达(光密度值为0)，而对照组K14表达未见明显下降(光密度值为5489.7±996.22)，两组比较差异有统计学意义(t=0.464，P＜0.05;图4-图5)。

Figure 3 Ki67 expressions in pterygium tissue after cultured 14 days.A:Normal pterygium tissue;B:Control group;C:Experiment group 翼状胬肉组织培养14 d后Ki67的表达情况。A:正常翼状胬肉组织;B:对照组;C:实验组

Figure 4 K14 expressions in pterygium tissue after cultured 14 days.A:Normal pterygium tissue;B:Control group;C:Experiment group 翼状胬肉组织培养14 d后K14的表达情况。A:正常翼状胬肉组织;B:对照组;C:实验组

Figure 5 Western blot results showed the pterygium tissue after cultured 7 days and 14 days，K14 was expressed in epithelial layer in control group，but almost not in experiment group Western blot结果显示翼状胬肉组织体外培养7 d后和14 d后，实验组上皮层中K14几乎无表达，而对照组可见有K14表达

3 讨论

翼状胬肉是眼科常见增生性致盲眼病［5］，常出现眼红、异物感、干涩感等眼表不适症状，其发生、发展和日光中紫外线有密切的关系［6］。Pax6是控制从低等线虫至人类多细胞动物眼球发育的关键基因。出生以后眼部的Pax6表达逐渐局限于角结膜、晶状体的上皮细胞、虹膜及视网膜的无长突细胞［7］。研究表明，Pax6是翼状胬肉发育过程中维持其上皮正常分化和生长所必需的，结膜上皮细胞表达Pax6蛋白，而角化的皮肤上皮细胞不表达Pax6［8］。Ki67作为增殖的指标，在正常的翼状胬肉组织上皮基底层细胞核中散在阳性表达;而角蛋白K14作为一个重要的上皮基底细胞的标志物和组成蛋白［9］，局限在正常结膜的上皮基底层，并在翼状胬肉和睑裂斑中表达上调。本组实验中Pax6、Ki67和K14的表达变化恰好可以说明翼状胬肉上皮鳞状化生情况。

在本研究中，我们通过体外培养基浸没法发现Pax6表达下调及Ki67、K14阳性表达的上调，证明了翼状胬肉上皮的鳞状化生(异常增殖及分化)模型体外构建成功。连续培养14 d后，实验组和对照组翼状胬肉组织上皮向外生长速度及细胞层数有明显差异。在实验组中，翼状胬肉上皮细胞层数无明显增加，同时上皮生长形态与培养前正常翼状胬肉组织相似;免疫组织化学染色显示Pax6表达与培养前正常翼状胬肉基本一致。这些均充分证明了雷公藤多甙可在一定程度上预防培养基浸没培养的翼状胬肉上皮鳞状化生。我们还对两组人翼状胬肉组织上皮细胞增殖标志蛋白Ki67和K14进行免疫组织化学染色，结果显示实验组翼状胬肉组织上皮Ki67和K14的表达量均明显低于其在对照组上皮的表达量，表明了雷公藤多甙可明显下调Ki67和K14在翼状胬肉上皮的阳性表达，在一定程度上预防培养基浸没导致的翼状胬肉上皮异常增殖。

雷公藤多甙有祛风活络、破瘀镇痛等功效，是治疗风湿性关节炎、肾病综合征、末梢神经炎、骨髓炎、麻风、红斑狼疮等的有效或特效药物。雷公藤有显著的抗炎和免疫抑制作用，其根部分离出的三种二萜环氧化合物，有明显的抗白血病作用，是国内首选的免疫抑制剂［10］，可用于治疗葡萄膜视网膜炎及角膜移植排斥反应［11-12］。雷公藤多甙有抗菌、抗病毒［13］和免疫调节作用，同时还能改善微循环和抑制成纤维细胞过度生长［14］。目前已有学者发现雷公藤多甙可用于治疗原发性和继发性肾病综合征及降低肾性蛋白尿的作用，有效率高达85%［15］。此外，雷公藤多甙辅助治疗紫癜型肾炎和难治性狼疮性肾炎可以提高患者的缓解率、降低其复发率，而且对预后有积极作用。雷公藤多甙还能与强的松交替使用治疗甲状腺相关眼病。另有学者认为雷公藤多甙可在短期内降低胰岛细胞抗体水平，对成人隐匿型自身免疫性糖尿病早期患者细胞免疫有调节作用，有改善胰岛β细胞功能的趋势。但对于雷公藤多甙在鳞状化生方面的研究尚未见报道。

雷公藤多甙可以抑制翼状胬肉上皮的鳞状化生，这是雷公藤多甙的一种全新的生物活性，它可用于眼表上皮和其他黏膜上皮鳞状化生性疾病的预防和治疗，这将为雷公藤多甙临床应用提供更加广阔的前景。同时，体外培养基浸没可成功并较稳定地培养人翼状胬肉上皮的鳞状化生体外模型，将为鳞状化生的病理生理过程及发病机制的研究以及临床鳞状化生性疾病的防治提供一个良好的研究模型，但翼状胬肉上皮鳞状化生的具体发生和发展机制及雷公藤多甙抑制翼状胬肉上皮鳞状化生的作用机制还需进一步探讨。

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