仔猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒定位研究

桑传兰，王 萧＊，多海刚，陈 嘉，梁 朗，董浩然

（1.广州中医药大学实验动物中心，广东广州510405；2.广东蓝岛生物技术有限公司，广东广州510555）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproduction and respiratory syndrome，PRRS）是20世纪80年代末期90年代初期出现的一种病毒性传染病，PRRS主要引起母猪和后备母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状。近年来关于PRRS的病原学、流行病学、临床症状和血清学诊断等方面已有大量报道，但至今对本病的发病机理还不清楚。本试验旨在用天津地区分离株PRRSV-SJ株滴鼻感染10日龄～15日龄PRRSV阴性的健康仔猪，观察PRRSV在仔猪体内靶器官的分布规律，明确其病毒的致病特点和发展规律，为进一步研究PRRSV的致病机理奠定基础，同时也为制定科学的防控措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 10日龄～15日龄健康的仔猪20头，经美国IDEXX公司PRRSV ELISA试剂盒检测为阴性，购自天津种猪场。

1.1.2 试验用病毒 PRRSV-SJ株由天津畜牧兽医研究所病毒室分离并保存，TCID50为10-5.58／0.1 mL。

1.1.3 主要试剂 PRRSV MAb 15A1来源于美国，由农业部兽医诊断中心提供；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H＋L）为北京中山生物技术有限公司进口分装产品；50mL／L的马血清（PBS稀释）为北京中山生物技术有限公司产品；3.3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）为北京市联合化工厂产品；苏木素（hematoxylin，进口分装）为北京化学试剂公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人工感染方法 15头仔猪滴鼻接种PRRSV-SJ毒株，3mL／头，每日测量体温，观察临床症状，并于感染后1、7、14、21、28d各处死3头。对照组5头滴鼻正常细胞培养物，3mL／头，与感染组相对应的时间，各处死1头。

1.2.2 取材 剖检取出的气管（中部）、肺、脾脏、扁桃体、淋巴结（肺门淋巴结、颈下淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结）肾脏等新鲜组织病料放入100 mL／L的中性缓冲福尔马林液中固定。

1.2.3 免疫组织化学法 常规制作石蜡切片［13］，切片常规脱蜡、洗涤、封闭后，滴加稀释比例适当的一抗，在湿盒37℃40min后，4℃冰箱内过夜，滴加稀释比例适当的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG（二抗）。在湿盒中37℃1h，洗涤后DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水、封片。

2 结果

2.1 气管

PRRSV感染1d后，病毒抗原主要分布于气管上皮和固有膜，并且从1d～28d的感染期间，气管中的抗原阳性细胞分布较少，阳性反应也不强烈（图1），阴性对照见图2。

2.2 肺脏

阳性细胞分布在肺泡间隔、肺泡壁上、支气管及细支气管上皮。但在感染21d～28d后，阳性细胞少，阳性反应也不强（图3），阴性对照见图4。

2.3 肺门淋巴结

感染1d～28d，阳性细胞主要分布在淋巴结皮质部及生发中心周边，阳性细胞量多，阳性反应也强烈（图5），阴性对照见图6。

2.4 扁桃体

感染1d～28d，阳性细胞主要分布在扁桃体的隐窝及周遍（图7），阴性对照见图8。

2.5 脾脏

感染7d后，抗原阳性细胞少，阳性反应弱。感染14d～28d期间，在髓质、皮质区都有大量的阳性细胞分布，阳性反应也很强（图9），阴性对照见图10。

图1 PRRSV感染气管Fig.1 Positive expression in nasal mucosa tissue

图2 气管黏膜阴性对照Fig.2 Negative expression in control nasal mucosa tissue

图3 PRRSV感染的肺组织Fig.3 Positive expression in lung tissue

图4 肺组织阴性照Fig.4 Negative expression in control lung tissue

图5 PRRSV感染的肺门淋巴结Fig.5 Positive expression in Bronchpulmonary lymph tissue

图6 肺门淋巴结阴性对照Fig.6 Negative expression in control bronchpulmonary lymph tissue

图7 PRRSV感染的扁桃体Fig.7 Positive expression in tonsil tissue

图8 扁桃体阴性对照Fig.8 Negative expression in tonsil tissu

图9 PRRSV感染的脾脏组织Fig.9 Positive expression in spleen tissue

图10 脾脏组织阴性对照Fig.10 Negative expression in spleen tissue

3 讨论

用间接免疫组织化学法观察了感染后1d～28 d的PRRSV抗原在气管、鼻黏膜、肺、脾、肾、淋巴结、扁挑体的分布动态。结果显示，病毒在感染1d后，PRRSV可以在肺、气管、淋巴结、扁挑体等组织中检出。说明经鼻内接种PRRSV-SJ株可在相应的组织中复制和增殖，这一结果与刘万铃等［1-2，5］试验结果相一致。

一般认为肺脏是PRRSV作用的原发性靶器官，是该病毒的主要侵害器官［4-5］。本试验研究发现肺组织中的病毒阳性细胞分布数量和阳性反应程度都不如文献中描述的分布广，数量多及阳性反应强。本试验的结果与任慧英等［10］用原位分子杂交技术检测仔猪肺组织中的病毒核酸阳性结果一致。Haynes J S等［12］报道两种不同致病性的毒株感染动物，强致病性的毒株与低致病性的毒株在同一时间内相比，强致病性的毒株能在更多的组织和更长的时间检出PRRSV阳性细胞，并且在肺中的阳性细胞数量及反应强度也高于低致病性毒株。本试验所用的PRRSV S J毒株是否属于低致病性毒株有待于进一步研究。

Rossw K D 等［3-6，11］认 为 PRRSV 通 过 鼻 黏 膜或呼吸道进入肺脏，引起肺内巨噬细胞增生并复制病毒，病毒很快进入肺组织血管，并在内皮细胞中进一步复制经血液循环引起全身病毒血症。本试验结果为，脾脏、肾脏在感染7d～28d后都可检出PRRSV抗原阳性细胞，但在14d～28d的抗原阳性细胞数量和阳性反应强度最强，从本试验的结果分析，PRRSV是以病毒血症的方式扩散到小血管，毛细血管，并在这里增殖导致相应的病变，脾脏、肾脏血管漏出的病毒又为大量的巨噬细胞吞噬和复制，因此在感染后期出现了大量的抗原阳性细胞，在这个试验中，作者认为脾是感染后期诊断和分离病毒的最佳病料。

Yoon I J等［5-6，9］研 究 发 现，PRRSV 感 染 12h后在鼻黏膜上皮细胞检出PRRSV阳性细胞，14d～21d后又再次检出，同时检测到鼻黏膜PRRSV病毒滴度高于血清病毒滴度，说明PRRSV是通过鼻黏膜排毒引起本病的感染的主要原因，因此鼻黏膜可作为本病的早期诊断。本试验从1d～28d都能在鼻黏膜中检出PRRSV病毒抗原，但鼻黏膜的阳性细胞数量及阳性反应强度都不如肺门淋巴结，扁桃体强烈，因此扁桃体和肺门淋巴结是早期诊断本病的最佳病料。

［1］ 刘万铃，余树民，徐志文，等.PRRSV SC-1株在人工感染仔猪体内的分布［J］.动物医学进展，2010，31（7）：36-38.

［2］ 陈申秒，马景霞，王金生，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒人工感染试验［J］.动物医学进展，2011，32（1）：110-114.

［3］ 李燕华，郭 鑫，杨汉春，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪园环病毒2型共感染猪组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的分布［J］.中国兽医杂志，2009，45（1）：9-12.

［4］ 杨 鸿，钱君娣，何启盖，等.病猪肺组织中PRRSV抗原免疫组织化学Envision法的原位检测［J］.中国兽医科学，2009，30（3）：237-240.

［5］ Rossow K D，Benfield D A，Goyal S M，et al.Chronological immunohistochemical detection and location of porcine reproduction and respiratory syndrome virus infection in gnotobiotic pigs［J］.Vet Pathol，1996，33：551-556.

［6］ Rossow K D，Bautista E M，Goyal S M，et al.Experimental reproductive infection in one-four-ten-week-old-pigs.［J］.Vet Diagn Invest，1994，6：3-12.

［7］ HaLbur P G，Paul P S，Frey M，et al.Comparative pathogenicity of nine US porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）isolation in five-week-old cesarean derived，colostrums-deprived pig model［J］.Vet Diagn Invest，1996，8：11-20.

［8］ Halbur P G，Paul P S，Frey M，et al.Comparison of the anti-gen distribution of two U.S.porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolation with that of lelystad virus［J］.Vet Pathol，l996，33：159-170.

［9］ Yoon I J，Joo H S，Christianson W T，et al.Field isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRS）vary in their susceptibility to antibody dependent enhancement（ADE）of infection［J］.Vet Microbiol，1997，55：277-287.

［10］ 任慧英，李文志，杨汉春，等.应用原位杂交技术研究母源抗体对PRRS病毒在体内的增值的影响［J］.中国预防兽医学报，2002，22（5）：372-374.

［11］ 尹训南，郭宝清，司昌德，等.猪生殖-呼吸综合征病毒在仔猪体内定位研究［J］.中国畜禽传染病，1997（5）：47-49.

［12］ Haynes J S，Halbur P G，Sirnarumit T，et al.Temporal and morphologic characterization of the distribution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）by in situ hybridization in pigs infected with isolated of PRRSV that differ in virulence［J］.Vet Pathol，l997，34（1）：39-43.

［13］ 何书海，陈宏智，焦凤超.动物病理组织切片制作方法的改良［J］.动物医学进展，2011，32（11）：130-132.