茶多酚对保加利亚乳杆菌生长的影响

蒋玉兰王 彬*毛 银,2左 茜,2

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.江南大学，江苏无锡 214000）

茶多酚对保加利亚乳杆菌生长的影响

蒋玉兰1王 彬1*毛 银1,2左 茜1,2

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.江南大学，江苏无锡 214000）

本文通过测定脱脂乳培养基中保加利亚乳杆菌菌体数目变化及产酸能力变化，研究茶多酚对保加利亚乳杆菌生长的影响。结果表明，高含量茶多酚对保加利亚乳杆菌酸牛乳发酵具有明显的抑制作用，低含量茶多酚抑制作用较小。随着茶多酚浓度的增加，相同发酵时间的菌体数目先增大后减小，当茶多酚添加量为2.0g/L的时候，菌体数目最多；茶多酚浓度相同时，随发酵时间的进行，酸牛乳的酸度逐渐增大，到发酵后期酸度趋于稳定，当茶多酚添加量为2.0g/L时，最终酸度最大；发酵后期，菌体形态极不稳定，大量保加利亚乳杆菌衰亡。茶多酚添加量过多，保加利亚乳杆菌产酸能力下降。而且茶多酚的颜色影响酸牛乳的色泽。

茶多酚 保加利亚乳杆菌 绿茶酸牛乳

目前，酸奶堪称最适合于人类的营养保健品。众所周知，茶含有多种功能成分，在酸牛乳制品中添加茶粉，有利于提升产品的营养价值和保健功效，同时茶多酚、茶氨酸等风味物质赋予产品全新的口感风味，改善了传统产品的物理性状，丰富了酸牛乳市场的产品体系，满足了不同消费群体对高品质产品的消费诉求。绿茶酸奶的开发，可为营养丰富的酸奶引入植物营养源，完善其营养结构，拓宽茶叶市场，同时形成清新怡人的茶风味酸奶[1]。本研究将为绿茶酸奶的开发奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

茶多酚（纯度99%），由中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院食品技术研究所提供；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），由江南大学微生物实验室提供；光明脱脂乳粉，购于杭州联华超市外海店。所用药品试剂均为分析纯。

DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；AL-204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电子显微镜，OLYMPUS BH-2，JAPAN；医用净化工作台YJ-875，苏州净化设备公司；生化培养箱SPX-150B-2型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；血细胞计数板，浙江省玉环县求精医用仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 保加利亚乳杆菌菌种的分离与纯化

利用MRS固体培养基，采用平板涂布法对保加利亚乳杆菌进行分离纯化。

1.2.2 保加利亚乳杆菌菌种的扩大培养

将纯化后的保加利亚乳杆菌接种于MRS液体培养基中，40℃条件下恒温培养24h，所得菌悬液备用。

1.2.3 茶多酚对保加利亚乳杆菌生长的影响

配置8%（m/m）的脱脂乳溶液，分别按0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0g/L的茶多酚添加比例向脱脂乳溶液中添加茶多酚，115℃灭菌8min，备用。按3%(v/v)的比例将保加利亚乳杆菌菌悬液接种于脱脂乳培养液中，40℃条件下恒温连续培养，分别在培养4、6、8、10、12、14和16h时测定培养液中菌体个数、酸度，并观察培养液中菌体形态。

1.2.4 保加利亚乳杆菌菌体形态变化

实验过程中发现，培养初期保加利亚乳杆菌菌体变大、数目变化较小、培养液酸度基本不变。本研究我们忽略培养初期（即调整期）菌体个数和培养液酸度的变化，只观察菌体形态。采用革兰氏染色镜检的方法观察保加利亚乳杆菌的菌体形态，拍摄照片并描述。

1.2.5 保加利亚乳杆菌计数

运用血球计数板进行计数[2]。视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数个数为度(每小格个数≤5）。计数区是由25个大方格组成的计数区，数左上、左下、右上、右下和中央1个大方格的菌数（即80个小格）。

计数公式（16格×25格的血球计数板）：

细胞数/mL=100小格内细胞个数/100×400× 10000×稀释倍数

1.2.6 培养基酸度变化

利用NaOH滴定法测定培养基的酸度[3]。培养基酸度的测定采用混合指示剂滴定法测定。用混合指示剂（百里酚蓝-酚酞作指示剂）滴定法。（滴定酸度终点判定标准颜色液的制备：取酸牛乳5.00g，置于150mL锥形瓶中，加40mL新煮沸放冷至40℃的水，混匀，再加入3滴0.125g/L的碱性品红溶液摇匀后，即为该样品滴定酸度终点判定标准颜色液。）

2 结果与分析

2.1 保加利亚乳杆菌菌体形态变化

将保加利亚乳杆菌按3%的比例接种于含有不同质量茶多酚的无菌脱脂乳培养基（1.2.3）中，随培养时间的进行，菌体形态发生了明显的变化。本实验基于不同茶多酚添加量的培养基中，菌体形态变化大致相同。现仅以茶多酚添加量为2.0g/ L的培养基为例进行说明。在培养调整初期，菌体物质增加，菌体生长而不分裂。在调整期末期（图1A），菌体代谢活动能力强，开始细胞分裂，出现个体小的菌体。对数期（图1B）的菌体以几何数增加，增长速度快，菌体很少死亡或不死亡，此时菌体大小仍不均一，但个体小的菌体数量急剧增多。稳定期（图1C）菌体生长速率下降，死亡率上升，细胞数达到最大值，新生菌体数和死亡菌体数相当，此时菌体形态相对稳定。衰亡期菌体死亡率增加，菌体少繁殖或不繁殖，菌体出现多形态、畸形或衰退型（图1D）。

2.2 保加利亚乳杆菌菌体数目变化

由表1可以看出，随着茶多酚浓度的增加，相同培养时间内，溶液中菌体数目先增多后减少，这是由于低含量茶多酚能够促进乳酸菌生长，而高含量茶多酚则抑制乳酸菌生长[4]。当茶多酚添加量为2.0g/L的时候，菌体数目增长最快，培养14h时的菌体数目达到最大值4.22×109。当茶多酚添加量相同时，随着培养时间的延长，培养液中的菌体数目大致呈上升趋势。

图1 不同培养时间保加利亚乳杆菌的菌体形态变化注：A:对数生长期；B：稳定期；C：稳定期后期；D：衰亡期Fig.1 The morphology of the Lactobacillus bulgaricus during different culture timeNote:A:Late adjustment phase;B:Log phase;C:Stationary phase D:Decline phase

表1 不同培养时间和茶多酚浓度的培养基中的保加利亚乳杆菌数目Table1 The number of the Lactobacillus bulgaricus in milk medium as tea polyphenols content and culture time change

2.3 培养基酸度变化

茶多酚的添加，对保加利亚乳杆菌产酸能力的影响较大。一般酸牛乳发酵，最后的酸度可达80～100T0左右[3]，而本研究添加茶多酚以后，保加利亚乳杆菌脱脂乳培养基的酸度最大才为48.3T0。究其原因，可能是因为市售酸牛乳的发酵剂为混合发酵剂，如同时包含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，混合发酵剂中菌种的生理活性的协同作用使得最终酸牛乳产品的酸度较大。已有研究表明，多酚的活性在豆奶发酵过程中不受影响[5]。随发酵时间的进行，酸牛乳的酸度逐渐增大，到发酵后期酸度趋于稳定，从表2可以看出，当茶多酚添加量为2.0g/L的时候，抑制效果相对较小，培养基最终酸度最大。另外，因为茶多酚为棕红色粉末，所以茶多酚的添加，在一定程度上影响了酸牛乳的色泽，所以生产上建议采用低浓度的茶多酚添加量。多酚含量占茶叶干重的20%～30%，绿茶酸牛乳的实际生产过程中亦应控制好绿茶粉的添加量。

表2 不同培养时间不同茶多酚浓度的培养基的酸度变化Table2 The medium acidity of culture as different tea polyphenols content and different culture time

3 结论与展望

高含量茶多酚对保加利亚乳杆菌酸牛乳发酵具有明显的抑制作用。尤其在发酵后期，菌体形态极不稳定，大量保加利亚乳杆菌乳杆菌衰亡。当茶多酚添加量为2.0g/L的时候，抑制效果相对较小，此时菌体产酸能力较强，酸牛乳的感官品质较佳，脱脂乳培养基中保加利亚乳杆菌数量最多。茶多酚等物质在乳制品中可以很好的保持其原有的活性，依然具有很多保健功能[6]。当茶多酚添加量过多时，大大抑制了保加利亚乳杆菌的活性，使其产酸能力下降，而且茶多酚的颜色影响了酸牛乳产品的色泽，建议生产采用≤2.0g/L的茶多酚添加量。

综上，绿茶酸奶产品的开发仍面临很多问题，后续工作应进一步加强茶多酚对乳酸菌影响的研究。筛选出最适合乳酸菌生长的绿茶粉添加量及最优绿茶酸牛乳发酵的发酵剂组合。为绿茶酸牛乳产品的开发与产品市场化打下坚实的理论基础，为农民增收创益。

[1] 孙卉子,朱科学,朱跃进,等.酸奶发酵对绿茶粉功效成分和抗氧化性的影响[J].食品工业科技,2011,32(9):131-33.

[2] Jay M J,徐岩,张继民,等.现代食品微生物学(第五版)[M].北京:中国轻工业出版社,2001.

[3] 杜磊,张光杰.酸奶在储藏过程中酸度、pH值、细菌的变化[J].河南工业大学学报(自然科学版),2011,32(2):73-75.

[4] 唐裕芳,张妙龄,冯波,等.茶多酚的抑菌活性研究[J].浙江林学院学报,2005,22(5):553-557.

[5] Patrick P,Mc Cue,Kalidas Shetty.Phenolic antioxidant mobilization during yogurt production from soymilk using kefir cultures[J].Process Biochemistry,2005(40):1791-1797.

[6] Coisson J D,Travaglia F,Piana G,et al.Euterpe oleracea juice as a functional pigment for yogurt[J].Food Research International, 2005(38):893-897.

Exploration Research on Effects of Tea Polyphenols on the Growth of Lactobacillus Bulgaricus

JIANG Yu-lan1,WANG Bin1*,MAO Yin1,2,ZUO Qian1,2

(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China;2.Jiangnan University,Wuxi 214000,China)

The effects of tea polyphenols on the growth of Lactobacillus bulgaricus was studied by determining the number of bacterium and the acid-producing ability.The results show that the inhibiting effect of tea polyphenols on Lactobacillus bulgaricus grown in milk decreased as the contents of tea polyphenols decreasing.As the contents of tea polyphenols increase,the number of bacteria increases but then decreases at the same fermentation time,and the number of Lactobacillus bulgaricus reaches the largest at the content of tea polyphenols of 2.0 g/L.As the fermentation time increases,the acidity of milk increases gradually at the same content of tea polyphenols at the beginning,while it is going to be stable later.When the content of tea polyphenols is 2.0 g/L,the acidity is the highest.During the late fermentation period,the morphology of Lactobacillus bulgaricus is very unstable and a large of them decays.When the content of tea polyphenols is over high,the acid-producing ability of Lactobacillus bulgaricus is decreased and the color of yogurt is affected by the color of tea polyphenols.

Tea polyphenols,Lactobacillus bulgaricus,Green tea powder yoghurt

中国茶叶加工 2012，（2）45～48

2012-02-09

科研院所技术开发研究专项资金（2010EG163313）；浙江省公益技术应用研究计划项目（2110C32042）

蒋玉兰（1982-），女，山东临沂人，硕士，主要从事天然植物资源多元化利用方面的研究。

*通讯作者：wangbin_313@126.com