不同产地冬虫夏草菌对寄主幼虫侵染力研究*

涂永勤，朱华李，张德利，陈仕江

（重庆市中药研究院，重庆 400065）

冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，又名虫草，系麦角菌科虫草属真菌中国被毛孢寄生蝠蛾属昆虫幼虫体内形成的虫菌复合体，是我国特有珍稀名贵中药材。具有补肺益肾、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、阳痿遗精、病后体虚、老年慢性咳嗽等疾病[1]。冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3 500 m~5 200 m局部高寒山区草甸地带，天然资源十分有限。近年来，由于价格上涨，过度采挖，加之生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。冬虫夏草菌能否感染寄主昆虫是冬虫夏草人工培殖的几个关键技术之一。有关冬虫夏草侵染寄主幼虫的技术虽然已有大量的研究[2-6]，但感染率普遍较低，除接种方法外，与不同菌株的侵染力有一定关系。本试验研究不同菌株对蝙蝠蛾幼虫感染能力的一些基本规律进行探索。在此方面，国内外尚未见有研究报道。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 虫种

小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis Tu et Ma，采自四川阿坝藏族羌族自治州小金县崇德乡崇德牧场；贡嘎蝠蛾H.gonggaensis Fu et Huang，采自四川甘孜藏族自治州康定县老榆林乡雅家埂；比如蝠蛾H.biruensis Fu.Sp.nov，采自西藏那曲地区比如县恰则乡；剑川蝠蛾H.jianchuanensis Yang，引自云南省剑川县老君山；石渠蝠蛾H.sp.采自四川省甘孜藏族自治州石渠县德荣玛乡。

1.1.2 菌种

采自全国主要冬虫夏草产区，即四川理塘、雅江、石渠、白玉、康定沙德、康定雅家埂、青海玉树、杂多县、西藏比如、丁青、云南德钦县白马雪山、剑川县老君山等地的天然冬虫夏草，经分离纯化、培养、转化为具有侵染能力的菌体形态（分生孢子）备用。

1.1.3 试验仪器、器具和试剂

BH2P Olympus生物研究显微镜，日本产；JSZ6S型体视镜，南京江南永新光学有限公司生产；LRH-250型光照恒温箱，上海产跃进医疗器械有限公司；SPX-250型生化培养箱，上海产跃进医疗器械有限公司；养虫盒、基质、饲料植物珠芽蓼、酒精及“84”消毒液等。

1.2 试验方法

1.2.1 不同产地冬虫夏草菌感染寄主昆虫试验

将不同产地冬虫夏草菌株经分离纯化、培养、转化而得的孢子悬浮液，进行接菌感染试验。每处理用30头幼虫，重复3次。于接菌6个月后，挑取幼虫血淋巴，在显微镜下，观察幼虫感菌情况。

1.2.2 冬虫夏草菌感染不同寄主幼虫试验

选用全国主要冬虫夏草产区寄主昆虫5个种进行感染试验，每处理30头幼虫，重复3次。于接种6个月左右时间，显微镜检查幼虫感染情况。

1.2.3 不同产地冬虫夏草差异比较

观察不同产地冬虫夏草子座、子囊壳及子囊孢子形态及色泽的差异。

2 结果与分析

2.1 寄主幼虫感染的检查

接种幼虫经过6个月左右后，挑去幼虫血淋巴，用显微镜检查幼虫感染情况。结果表明,在显微镜下，感染幼虫血淋巴内可以见到大量密集、形态相似、长宽相近的菌丝段或分生孢子（图1、图2）。这些菌体，经交结成菌核，萌发产生子座（Stroma），并最终形成冬虫夏草（Cordyceps sinensis） 药材[7]。

图1 冬虫夏草菌分生孢子（高倍）

图2 冬虫夏草菌分生孢子（低倍）

2.2 不同菌株感染寄主幼虫

用冬虫夏草菌的不同菌株对寄主幼虫（小金蝠蛾）接种，感染实验结果见表1。

由表1可知，除老君山虫草菌不能侵染寄主幼虫外，其他菌株都能不同程度地侵染小金蝠蛾，但侵染力有差异。小金虫草菌菌株最高感染率为72.22%，西藏比如虫草菌株感染率最低为45.56%。

2.3 不同寄主蝠蛾幼虫感染冬虫夏草菌

表1 不同菌株感染寄主幼虫情况

不同种类寄主蝠蛾幼虫感染冬虫夏草菌的实验结果见表2。

表2 不同寄主昆虫感染情况

从表2可以看出，冬虫夏草菌（康定沙德菌株）除不能侵染剑川蝠蛾外，对其他虫草蝠蛾均能侵染。但对不同种寄主幼虫的侵染力有差异。贡嘎蝠蛾感染率最高为75.56%，比如蝠蛾感染率最低为58.89%。剑川蝠蛾不能感染冬虫夏草菌，而老君山虫草菌亦不能侵染其他虫草蝠蛾，说明两者可能为不同的种，这也证明了陈吉岳等[8]的研究。

2.4 冬虫夏草菌菌株间的比较

冬虫夏草菌菌株内或菌株间子实体在色泽上有一定的变化，由灰（枯）黄色、深褐色到黑色的变化，老君山虫草无色泽变化，为棕黄色或棕色。冬虫夏草各菌株多生长在高山草甸土中，而老君山虫草多在林下与苔藓混生。老君山虫草的子座纤细很长，棕色，产孢部分短，子囊壳较大，排列不规则（图3）；而冬虫夏草的子座一般较短且粗，呈长圆锥体状，产孢部分比较长，差不多占到了子座的一大半，子囊壳较小，排列紧密规则（图4）。在显微镜下，老君山虫草的子囊孢子细长（图5），冬虫夏草菌的子囊孢子相对较粗短（图6）。不同产地冬虫夏草菌在子囊孢子形态上没有差别。

3 讨论与结论

图3 老君山虫草子座及产孢器

图4 冬虫夏草子座及产孢器

图5 老君山虫草子囊孢子

图6 冬虫夏草子囊孢子

寄主幼虫感染冬虫夏草菌是冬虫夏草人工培殖的关键技术之一。现有研究表明中国被毛孢[9,10]是冬虫夏草菌的无性型。目前，冬虫夏草菌侵染寄主蝠蛾的机理尚不清楚。有人从冬虫夏草子实体中分离无性型时，除分离出中国被毛孢 （Cordyceps sinensis） 外，还分离到中国拟青霉（Paecilomyces sinensis Chert,Xiao＆Shi）、中国金孢霉（Chrysosporium sinense Liang） 和虫生簇孢 （Sporothrix insectorumde Hong＆Evans）等多种真菌。用分子生物学方法证明，在子座成熟过程中，中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉有DNA共存和竞争增殖[11-13]。所以，认为冬虫夏草菌侵染寄主幼虫是冬虫夏草菌与蝙蝠蛾拟青霉等菌的复合侵染。但是，本研究用经纯化的冬虫夏草菌孢子液为菌种，且基质、饲料都经过严格消毒处理，冬虫夏草菌仍然能使蝠蛾幼虫感染成功，获得了冬虫夏草药材。重要的是在人工饲养蝠蛾幼虫中，蝠蛾幼虫一旦被蝙蝠蛾拟青霉菌侵染，无论虫体打小，幼虫最早10 d左右死亡，最晚在1个月内全部死亡，死亡虫体内被拟青霉菌所充满，大量孢梗束伸出，顶端产生大量近球形的分生孢子。如果侵染有拟青霉菌参与，就不大可能长成冬虫夏草药材。由此证明冬虫夏草菌侵染寄主幼虫，应该是由冬虫夏草菌单一侵染的结果，而非与其他菌的复合侵染。有关冬虫夏草菌侵染寄主幼虫的过程及机理有待深入研究。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．北京：中国医药科技出版社，2005．

[2]杨跃雄，杨大荣．虫草菌感染虫草蝠蛾幼虫的研究[J].动物学研究，1989，10(3)：227-231.

[3]王忠，马启龙．冬虫夏草全人工培养感染实验结果[J].甘肃农业科技，2001(7)：40-41．

[4]徐海峰.蝙蝠蛾多毛孢感染拉脊蝠蛾的研究[J].四川草原，2005(5)：15-16，40.

[5]廖志勇．冬虫夏草的染菌技术研究[J]．食用菌，2005(6)：18．

[6]涂永勤，张德利．蝠蛾属幼虫感染冬虫夏草菌的实验研究[J].食用菌，2010(3)：16-17.

[7]曾纬，尹定华．冬虫夏草菌及寄生阶段的生长发育[J].菌物学报，2006，25(4)：646-650．

[8]Ji-Yue Chen,Yong-Qiang Cao,Da-Rong Yang,et al.A new species of Ophiocordyceps(Clavicipitales,Ascomycota)from southwestern China[J].Mycotaxon,2011,115(1):1-4.

[9]杨金玲，肖薇．蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的分子系统学研究[J]．药学学报，2008，43(4)：421-426.

[10]李增智，黄勃．确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据[J].菌物系统，2000，19(1)：60-64.

[11]朱佳石，郭英兰，姚艺桑，等．冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存和竞争增殖力及化学成分指纹谱的变化[J].菌物研究，2007，5(4)：214-224.

[12]朱佳石，高凌，李晓红，等．冬虫夏草的成熟过程中冬虫夏草菌突变基因型的存在和它们差异表达的动态变化[J]．中国草地学报，2010，32(supp1.)：76-78.

[13]高凌，李晓红.MassARRAY单核苷酸多态性MALDI-TOF质谱基因分型法检测未成熟冬虫夏草子座中多个冬虫夏草菌突变基因型[J].北京大学学报：医学版，2011，43(2)：259-266.