大黄素对肠黏膜屏障损伤的保护作用及机制研究

白小武，嵇 武，丁博文，张 强，李秋荣，李 宁

(本文编辑:潘雪飞; 英文编辑:王建东)

肠缺血再灌注(IR)是临床多种疾病的病理生理过程，进一步发展可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)等的发生。研究表明大黄素对肠缺血再灌注损伤有保护作用，故本实验采用大鼠肠缺血再灌注模型，观察大黄素对肠缺血再灌注肠黏膜细胞凋亡及紧密连接破坏的影响，探讨大黄素保护肠黏膜屏障的机制，为临床治疗肠缺血再灌注提供理论依据，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性健康清洁级SD大鼠48只，8～9周龄，体重200～250 g，由南京军区南京总医院比较医学科提供，实验动物使用许可证号:SYXK(军)2007-029;饲养室温度22～23℃，环境湿度50%，喂以标准的大鼠饮食。

1.2 药物与试剂 大黄素购于中国药品生物制品检定所;兔抗大鼠Claudin-1抗体和Occludin抗体购于Santa Cruz公司;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法(TUNEL)染色试剂盒、山羊抗兔IgG-HRP二抗、牛血清白蛋白(BSA)购于南京碧波生物科技有限公司;β-actin抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;考马斯亮蓝蛋白浓度试剂盒购于南京建成生物工程研究所;全蛋白酶抑制剂混合片购于罗氏公司;Western Blot上样缓冲液购于Fermentas公司。

1.3 主要实验仪器 JEM-1010透射电子显微镜(日本电子株式会社)。

1.4 动物分组及模型制作 48只SD大鼠正常喂养1周后随机分为假手术(S)组、模型(IR)组、模型+生理盐水(IRS)组和模型+大黄素(IRE)组，每组12只。大黄素用生理盐水配制成10 g/L的混悬液备用。IRE组按40mg/(kg·d)剂量给予大黄素灌胃，IRS组给予等量的生理盐水灌胃，两组均为1次/d，连续7 d。实验第7天给药2 h后，采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭/松夹方法制备肠缺血再灌注模型［1］。假手术组只分离SMA，不夹闭;缺血30 min，再灌注2 h后麻醉大鼠、开腹取距回盲部5 cm处回肠标本。

1.5 病理组织学观察 取2 cm回肠标本置于10%的中性甲醛中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察病理变化，按照Chiu’s损伤分级评分［2］。

1.6 透射电镜观察 将回肠标本修成1 mm×1 mm×5 mm大小，2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，脱水、浸透、包埋、超薄切片，透射电子显微镜观察肠黏膜上皮细胞间紧密连接的改变。

1.7 肠黏膜细胞凋亡指数检测 取1cm回肠标本迅速冻于液氮中，冰冻切片，按照TUNEL试剂盒说明书染色，光学显微镜下观察。400倍视野内每组随机选取100个相邻视野，计算凋亡指数。

1.8 Western Blot半定量测定 Claudin-1、Occludin蛋白含量 取3 cm回肠标本，纵向剪开肠腔，用载玻片轻轻刮取并收集肠黏膜，置于－20℃保存。将保存组织放入组织匀浆器内，每100 mg加1 ml全蛋白提取液(0.15 mol/L氯化钠+0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷+1.0%聚氧乙烯辛基苯基醚，每10 ml+全蛋白酶抑制剂混合片1片)研磨。12000r/min(离心半径6 cm)，4℃离心20 min，取上清液，测定总蛋白含量。分别取40μg的总蛋白加入上样缓冲液，煮沸10 min后，先行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5 g/L BSA室温封闭1 h，加入 Claudin-1、Occludin 和 β-actin(1∶500)抗体，4℃孵育过夜，漂洗后加入IgG-HRP二抗(1∶3000)，室温孵育1 h，漂洗、曝光成像。QuantityOne软件分析测定结果，计算目标蛋白相对含量=目标蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法(Claudin-1、Occludin的含量)，方差不齐时用Dunnett T3法(Chiu’s评分、凋亡指数)，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄素对肠黏膜组织细胞超微结构的影响 S组肠道黏膜形态完整，绒毛结构清晰，有部分绒毛尖端上皮下间隙略增宽，紧密连接和桥粒结构清晰，形态完整，可见大量微绒毛，排列整齐。IR组肠道黏膜结构紊乱，绒毛破损，上皮细胞大量脱落，固有层暴露、出血，炎症细胞在内皮下聚集，微绒毛大量脱落、断裂，紧密连接结构模糊、肿胀，致密物质减少。IRS组病理表现、电镜表现与IR组相似。IRE组与IR组和IRS组比较，肠黏膜损伤程度较轻，上皮下间隙扩张，部分绒毛顶端破损、脱落，毛细血管充血，电镜下破坏明显减轻，微绒毛增多，紧密连接结构大致可见，肿胀缓解(图1、图2)。统计分析，与S组相比，IR组、IRS组、IRE组病理损伤明显严重(P＜0.05);IR组与IRS组比较无明显差别(P＞0.05);而IRE组与IR组、IRS组相比病理损伤明显减轻(P＜0.05)。见表1。

2.2 大黄素对肠黏膜细胞凋亡指数的影响 S组上皮及隐窝处可见少量凋亡细胞。IR组可见弥散性分布的凋亡细胞，数量明显增加。IRS组与IR组结果相似。IRE组与IR组相比凋亡细胞数量明显减少(图3)。统计分析，与S组相比，IR组、IRS组、IRE组凋亡细胞数量增多(P＜0.05);IR组与IRS组相比无明显差别(P＞0.05);而IRE组与IR组、IRS组相比凋亡细胞数量减少(P＜0.05)。见表1。

2.3 大黄素对肠黏膜紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin含量的影响 S组正常表达Claudin-1、Occludin蛋白;IR组和IRS组Claudin-1、Occludin蛋白表达明显下调(P＜0.05)，两者之间无明显差异(P＞0.05);IRE组 Claudin-1、Occludin蛋白表达明显高于IR组和IRS组(P＜0.05)。见表1。

图1 四组大鼠回肠病理改变(HE×200)

图2 四组大鼠肠黏膜上皮细胞超微结构电镜变化(×50000)

图3 四组大鼠肠黏膜细胞凋亡的TUNEL检测(二氨基联苯胺染色 ×400)

表1 四组大鼠肠黏膜屏障损伤指标比较(±s)

表1 四组大鼠肠黏膜屏障损伤指标比较(±s)

注:与 S组比较，*P ＜0.05;与 IR组比较，#P ＜0.05;与 IRS组比较，ΔP ＜0.05

组别 n Chiu’s病理评分 凋亡指数(%) Claudin-1(相对含量) Occludin(相对含量)S 组 12 0.44 ±0.66#Δ 1.04 ±0.96#Δ 7.22 ±0.85#Δ 2.24 ±0.53#Δ IR 组 12 3.40 ±0.97* 10.77 ±2.22* 3.68 ±0.85* 1.26 ±0.46*IRS 组 12 3.36 ±1.02* 10.69 ±2.22* 3.46 ±0.78* 1.13 ±0.38*IRE 组 12 2.47 ±0.98*#Δ 6.54 ±1.94*#Δ 7.34 ±1.28#Δ 2.29 ±0.48#Δ

3 讨论

肠缺血再灌注损伤是休克、创伤、感染等多种临床常见疾病重要的病理生理环节，可以引起肠黏膜屏障受损，进一步发展可导致肠内细菌及内毒素移位，诱发SIRS、MODS和肠源性感染。肠缺血再灌注导致肠黏膜屏障受损的机制是一个复杂的过程，目前还未完全阐明，主要包括组织氧代谢障碍、氧自由基损伤、细胞因子和炎症介质的作用、白细胞与内皮细胞的相互作用等。西医预防和治疗肠黏膜屏障受损的措施一直存在不足之处，相关研究也未取得突破性进展［3］。近年来，人们逐渐把治疗研究的重点转移到了中医药方面，并取得了一些成就［4］。现代研究证实大黄素具有改善肠道血液循环、促进肠道蠕动、刺激肠道分泌和杀灭微生物、降低肠道黏膜通透性、抗炎及免疫调节等作用。在急性重症胰腺炎中，大黄素可以显著降低血清淀粉酶、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的水平，减轻胰腺组织病理损伤，抑制NF-κB(核因子)活化，诱导细胞因子TGF-β1(人转移生长因子β1)基因的表达，促进多种细胞外基质成分合成，增加胰腺组织DNA合成和蛋白含量，参与胰腺组织的再生和修复。亦有研究证实大黄素对重症胰腺炎所致肠黏膜屏障损伤也具有保护作用，通过抑制小肠潘氏细胞分泌的隐凹素-4mRNA的下调［5］，并下调Bax(促凋亡因子)基因的表达抑制肠黏膜细胞过度凋亡，从而减轻肠黏膜屏障的损害，降低肠道内毒素的易位［6］。大黄素可以通过增加大鼠肝移植后Bcl-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白)蛋白表达，抑制肝细胞的凋亡，从而减轻急性排斥反应程度［7］。大黄素预处理在肝脏缺血再灌注时可以降低丙二醛的含量，减轻了脂质过氧化损害程度［8］。本实验观察了大黄素对肠缺血再灌注肠黏膜病理组织学的影响，大黄素预处理组肠黏膜病理损伤明显减轻，Chiu’s评分降低，从而从病理学的角度明确了大黄素对肠缺血再灌注肠黏膜屏障具有保护作用。

肠黏膜屏障主要由机械屏障、生物屏障、免疫屏障［9-10］及化学屏障构成，其中机械屏障是肠黏膜屏障的根本。机械屏障的结构基础是肠黏膜上皮细胞及细胞与细胞之间完整的连接。其中肠黏膜上皮细胞死亡的主要方式是细胞凋亡，约占死亡细胞总数的80%。在肠缺血再灌注的过程中，细胞凋亡起了非常重要的作用。肠黏膜细胞凋亡的增加与肠缺血再灌注损伤密切相关［11］。大量的凋亡导致肠黏膜屏障功能障碍，上皮细胞通透性增加，肠内细菌和内毒素移位［12］。本研究结果显示大黄素预处理可以减少肠缺血再灌注造成的肠黏膜细胞凋亡。

细胞与细胞之间的连接方式有多种，包括紧密连接、粘附连接和缝隙连接，最主要的方式是紧密连接。紧密连接的破坏可以导致水和物质跨上皮转运的紊乱，是肠黏膜屏障受损的重要环节。紧密连接破坏的最重要的标志是紧密连接蛋白的减少。本实验结果显示，大黄素预处理组肠缺血再灌注肠黏膜上皮之间紧密连接的破坏明显减轻，微绒毛增多，紧密连接蛋白的含量增多。

上述研究证实大黄素可以保护肠黏膜细胞减少凋亡，保护紧密连接结构减少破坏，维护肠黏膜屏障的完整性，降低肠黏膜通透性，进一步证实了大黄素对肠道缺血再灌注所致肠黏膜屏障损伤具有保护作用，为大黄素在肠黏膜屏障损伤中的预防和治疗提供了理论依据。

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