TDI诱发变应性鼻炎豚鼠模型的建立

肖红兵，谢彦兵，李宝国，李海兵，，邸婵娟，胡 明，刘永学

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一种特异性呼吸道疾病，发病率一直呈上升趋势，其临床的特征是鼻充血、鼻塞、鼻涕、喷嚏、鼻痒，有时也会失去嗅觉［1］，严重影响人们的身体健康和生活质量。

开展AR的实验研究，往往离不开理想的动物模型。就AR动物模型而言，目前国内外公认的方法即甲苯-2，4-二异氰酸酯(TDI)或卵清蛋白(OVA)诱导法［2-3］。前者具有建模周期短、操作方便、试剂便宜等优点，但目前大多文献报道的实验方案不够详尽和完善，并且在实验过程中经常有动物死亡等现象。本研究在前期预实验的基础上，优化了TDI诱发AR豚鼠模型的方案，取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Hartley豚鼠30只，雌雄各半，体重400～450 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:SCXK(京)2006-0009。由军事医学科学院丰台动物中心饲养，每笼5只，环境温度:(23±2)℃，湿度:(55±5)%，动物自由摄食摄水。

1.2 试剂 TDI(天津市津科精细化工研究所，批号:20031012)，橄榄油(国药集团化学试剂有限公司，批号:F20081006)，布地奈德鼻喷雾剂(阿斯利康制药有限公司，批准文号:国药准字J20090079，批号:F20081006)，乌来糖(氨基甲酸乙酯)(国药集团化学试剂有限公司，批号:T20080917)，生理盐水(石家庄四药有限公司，批号:100427117)，豚鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA试剂盒(北京中昊时代生物技术中心，批号:20100817)，磷酸组胺对照品(中国药品生物制品检定所批号:150510-200412)等。

1.3 仪器及器械 微量移液器(法国GILSON)，台式高速离心机(Sigma公司)，海尔超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)，全自动酶标仪(Thermo Multiskan MK3公司)，高效液相Waters2695及多通道荧光检测器Waters 2475(沃特世科技有限公司)。

1.4 动物分组及模型制作方法

1.4.1 分组 将30只SPF级豚鼠根据体重随机分为三组，分别为正常对照组、AR模型组，布地奈德喷鼻剂治疗组，每组10只，雌雄各半。

1.4.2 建模 致敏方案遵照 Tanaka等［3］报道方法，部分作修改。除正常对照组外，其他两组豚鼠用10%TDI(分别取0.1ml TDI和0.9ml橄榄油，在常温下将两者充分混匀即得浓度为10%的TDI溶液，现配现用)进行双侧鼻孔滴鼻，用量按每侧12.5 μl/kg计算，每日1次，连续7 d后，改为隔日1次，直至第21天结束。从第一次给予TDI开始，每天观察并记录每只动物的临床症状，根据症状评分标准，计算临床评分。在TDI滴鼻第7天，致敏动物评分若超过5分，则表明动物模型制作成功。正常对照组豚鼠，以橄榄油替代10%TDI，用法、用量与上述模型组相同。

评分标准:以鼻部症状和体征为主要观察内容，自给10%TDI开始，依据鼻痒、喷嚏、流涕等出现的时间长短、轻重程度、次数多少为评分标准并记录。鼻痒程度:轻擦鼻几次，记1分;连续抓挠鼻、面部记2分。喷嚏:1～3个为1分，4～10个为2分，11个以上为3分。流涕:流至鼻前孔为1分，超过鼻前孔为2分，流涕满面为3分。各症状记分累加，即为临床评分。其症状观察时间为每次给致敏物开始计时，共 30 min。

1.5 给药方案 布地奈德给药组豚鼠从第8天开始给药，经双侧滴鼻给药，每侧鼻孔给药用量为10 μl/kg，每天给药1次，连续14 d。若给药当天动物需TDI激发，则在给药60min后再用TDI，随后进行相应的症状评分。正常对照、模型组动物，按照给药组相同的方案均给予等体积生理盐水。

最后一次给药、评分完毕，以25%的乌拉坦(1 g/kg)经腹腔注射麻醉动物，腹主动脉取血3～5 ml于离心管中，再经离心制备血清，－80℃保存，用于检测血清IgE含量。然后沿豚鼠鼻道切开，暴露鼻中隔，小心分离取出鼻中隔两侧的鼻黏膜组织，一部分组织立即经甲醛固定，按常规步骤制片并进行HE染色，用以观察鼻黏膜组织病理学变化，另一部分置－80℃保存，用以测定组胺含量。

1.6 病理标本及切片制作方法 病理标本按常规组织制片技术制片，HE染色［4］。

1.7 血清中IgE含量测定方法 采用ELISA法检测血清中IgE含量，详细步骤见说明书及有关文献［5］。

1.8 鼻黏膜组织中组胺测定方法 采用荧光分光光度法检测组胺含量［6］。

2 结果

2.1 豚鼠临床评分变化 致敏7 d后，模型组及治疗组每只动物出现典型的AR症状，其临床评分均超过5分，说明造模成功。正常对照组仅少数动物出现轻抓鼻。治疗组从第8天给药开始至第21天给药结束，其临床评分逐渐出现明显下降，即随着治疗时间的延长，症状明显缓解(表1)。

2.2 豚鼠喷嚏数量变化 喷嚏系AR的典型症状之一。随着致敏时间的延长，模型组及治疗组豚鼠的喷嚏数明显增加，从第8天开始，治疗组给予治疗药物后，喷嚏数逐渐明显减少，症状明显缓解。而在实验期间，正常对照组动物几无喷嚏。

2.3 豚鼠鼻黏膜组织病理学改变 光镜下可见:模型组鼻黏膜损伤较严重，表现为部分黏膜上皮脱落，固有层血管扩张充血，组织水肿，伴嗜酸性粒细胞及其他炎症细胞浸润;空白对照组黏膜上皮呈柱状排列，未见炎症细胞浸润;治疗组鼻黏膜损伤较轻，仅见少量嗜酸性粒细胞浸润(图1)。

2.4 豚鼠血清中IgE含量变化 模型组血清IgE含量(1.46μg/ml)较高，正常对照组血清IgE含量(1.25μg/ml)较低，治疗组血清IgE含量(1.41μg/ml)较模型组为低，与模型组比较，P＜0.05。

2.5 豚鼠鼻黏膜组胺含量变化 正常对照组鼻黏膜组织组胺平均含量(3.02 ng/mg)较低，模型组(4.76 ng/mg)较高，治疗组(3.51 ng/mg)较模型组为低，与模型组比较，P＜0.05。

表1 各组动物的临床评分动态结果

3 讨论

选择并建立合适的AR动物模型，对于AR治疗药物药效学的研究具有十分重要的意义，其他有关AR的研究内容，如病因学、发病机制、预后等，也都离不开成功的动物模型。本实验建立TDI诱导的AR豚鼠模型，是目前国际上公认的模型之一［7］。此外，卵白蛋白和日本雪松花粉诱导的AR动物模型亦常被选用。但与后两者相比，本研究的模型具有周期短、操作简单、经济、容易成功等优点。关于建模动物，文献报道较多。有报道表明豚鼠最适于AR模型的建立，被广泛应用于病理机制、新药研究等［8-9］。品系方面，Dunken Hartley品系使用最为广泛［10］。

结合本研究前期预实验结果，提示选择豚鼠进行AR模型制作时应注意以下问题:动物级别和品系最好选择SPF级Dunken Hartley品系豚鼠，体重达到400 g以上;动物饲养条件要求在SPF级动物房饲养，严格保持恒定的温度和湿度，环境应整洁安静。否则，动物容易死亡。我们第一次预实验结束时，10只豚鼠仅存3只;第二次预实验结束时，20只豚鼠仅存11只。分析原因:两次预实验选用的豚鼠为清洁级，体重在250～300 g之间;且饲养条件达不到SPF级;建模试剂TDI属有毒有机化合物，而且其剂量为每侧鼻孔14.5μl/kg，对豚鼠损伤大。因此正式实验中选择了SPF级豚鼠，饲养在SPF级动物房，并将TDI剂量调整为每侧鼻12.5μl/kg。许多文献报道TDI剂量为每侧鼻5μl/kg，在实验中发现随着动物体重的增长，5μl/kg的剂量激发动物表现的症状并不明显。经实践证明，12.5μl/kg剂量使动物模型症状明显而又不致死亡。

目前，国际上评价AR的药效学指标主要包括:临床症状评分，喷嚏数，鼻痒次数，血清IgE含量，鼻黏膜组织病理学变化，鼻黏膜组胺含量，血管渗透性，鼻充血等［11］。本研究采用其中5个指标用于评价AR模型，以保证模型的可靠性。

图1 各组动物鼻黏膜病理学改变(HE×200)

实验所选择的布地奈德鼻喷雾剂，是目前治疗AR的一线药物［12］，结果表明其能有效地缓解豚鼠变应性鼻炎的鼻症状，改善鼻黏膜组织病理学的损伤，抑制血中IgE和鼻黏膜中组胺的生成，阻止局部嗜酸性粒细胞的浸润等。而实验模型对药物的治疗反应明确，亦证实TDI诱发的豚鼠模型可较大程度地反映人类AR的发病特点，方法简便易行且成功率高，为今后开展AR防治药物的药效学研究奠定了良好的基础。

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