血水草白屈菜红碱杀灭日本血吸虫尾蚴预防感染的研究

罗 珊,虞 欢,王 玲,黄琼瑶,刘年猛,孙 慧,彭 飞

（湖南师范大学医学院寄生虫学教研室,湖南 长沙 410013）

药物灭螺在防治血吸虫病感染及流行中具有极其重要的意义。目前,化学控制仍然是灭螺的最重要方法,但化学灭螺剂价格昂贵,对人、畜、鱼等多有毒害,且易造成环境污染,且有限的几种化学灭螺剂易致螺产生耐药性。植物杀螺剂是世界卫生组织(WHO)推荐开发的杀螺剂。其具有资源丰富、可就地取材、易生物降解、对环境污染小等优点,而成为药物灭螺研究的重要内容。迄今为止大约有1000多种植物被用于灭螺实验,已有近百种植物杀螺剂有效成分的化学结构基本阐明,分属于皂苷、鞣质、萘醌、烯基酚、黄酮、一萜倍半萜、生物碱及呋喃香豆素等化学类[1]。从植物中提取的某些生物碱类化合物有较强的杀螺作用,如：麻风树的种子、枝、叶中提取的生物碱[2]；棕榈科植物槟榔种子中提取的生物碱-槟榔碱[3]。课题组的前期研究已证实,我国特有的物种-罂粟科(Papaveraceae)血水草属植物血水草(Eomecon chionantha Hance)的根及根茎中提取的生物总碱具有杀灭钉螺的作用[4],对鱼毒性较低[5]。从血水草生物总碱中可分离到含量丰富的单体CHE,呈淡黄或浅白色粉末状,目前研究发现其具有抗菌、抑菌作用,具有清热解毒、抗菌消炎的作用。为探寻CHE杀灭日本血吸虫尾蚴的效果,我们进行了玻片法灭蚴、实验室防护动物血吸虫感染的实验,证实CHE有较好杀灭日本血吸虫尾蚴、防护动物感染的作用,具体报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血水草生物碱制备

秋季从湖南省桃江县人形山采集血水草,取根及根茎,洗净、晾干,碾成粗末,按常规方法[6]提取CHE,备用。

1.1.2 阳性钉螺、尾蚴

阳性钉螺由湖南省血吸虫病防治研究所提供,实验当日逸放日本血吸虫尾蚴。

1.1.3 小白鼠

129只,昆明鼠 22～24克,单性(雌性),购自中南大学湘雅医学院动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 玻片法灭蚴实验

采用玻片法灭蚴[7],置浓度为100 mg/L、50 mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L 的 CHE药液。取18mm×18mm盖玻片置于载玻片上,分别吸取各浓度的药液100μL滴加于盖玻片上,每片在解剖镜下计数血吸虫尾蚴50条左右,观察15 min、30 min、60 min、120 min尾蚴存活情况。同时设清水对照。保持室温23～25℃。尾蚴死活判断标准：镜下断尾、表皮肿胀,用解剖针触及尾蚴,不活动者均判为死亡,记算死亡率。

1.2.2 实验室防护动物血吸虫感染实验

2 结果

2.1 玻片法灭蚴实验

尾蚴接触低浓度CHE溶液后短时间内活动与对照无明显差异,随时间延长主要表现为活力下降、不活动,在死亡过程中大多无明显断尾。尾蚴接触 3.125mg/L、6.25mg/LCHE溶液 30min无死亡,60min死亡率为 22%、36%,12.5mg/L、25mg/L 30min无死亡,60min死亡率为74%、88%。随着浓度增高,尾蚴 100%死亡时间缩短,50mg/L、100mg/L,60min内尾蚴全部死亡。12.5mg/L以上,120min时尾蚴全部死亡。结果详见表1。

表1 CHE杀灭尾蚴实验结果

2.2 实验室防护动物血吸虫感染实验

实验结果见表2。用SPSS17.0软件作卡方检验,100mg/L、50mg/L浓度的防护率与对照组差异有显著性(P<0.05)。经实验室研究证实CHE有较好的杀灭日本血吸虫尾蚴的作用。实验中发现：动物实验50mg/L即有显著保护效果,明显优于镜下观察尾蚴存活情况的结果,可能为经药物浸杀后尾蚴虽然未死亡但已失去穿透能力,因而无法感染所致。可进一步作现场实验及制成涂肤剂进行皮肤防护实验。

表2 CHE杀灭血吸虫尾蚴的动物实验结果

3 讨论

血水草别名水黄连,系罂粟科白屈菜族血水草属多年生草本植物,广泛分布在我国长江流域、华南、华东、西南地区,西北秦岭也有分布。据《新华本草纲要》记载,其味苦,性寒,有小毒,具有清热解毒之功效。民间用于治疗急性结肠炎、眼结膜炎、疔疮痈肿及毒蛇咬伤等症[8]。血水草生物总碱的主要成分为白屈菜红碱、血根碱 (Sanguinarine)、原阿片碱(Protopine)、α-别隐品碱(α-allocyptopine)、氧化血根碱(Oxysanguinarine)、白屈菜红碱 (Chelerythridimerine),属苯骈菲啶(Benzophenanthrdine)型生物碱[9]。

本研究证实：①CHE在短时间、低浓度下能杀灭水体中的日本血吸虫尾蚴；②CHE在50mg/L浓度时即能较好地防护动物感染日本血吸虫尾蚴,且其防护动物感染尾蚴的效果明显强于对尾蚴的直接杀灭效果,可能是由于经药物浸杀后的一部分尾蚴虽然未死亡但已失去穿透能力,因而无法进入动物体内或是能够进入动物体内但其生存能力已明显减弱的缘故。本研究中单体CHE杀灭尾蚴及防护动物感染的效果与课题组前期的血水草生物总碱杀灭钉螺、尾蚴和防护动物感染研究结果[10]相比,CHE的作用效果要稍弱于总碱,提示血水草总碱中可能包含多种有效成分,总碱的药效作用是几种有效、无效、强效或弱效成分的组合效果。据相关文献报道,植物灭螺剂的纯度在一定程度上正比于其灭螺效果。Tripathi等研究Punica granatum和Canna indica两种植物灭螺剂杀螺效果时,发现其色谱纯提取物的杀螺效果明显高于乙醇粗提物的杀螺效果,在提高植物灭螺剂纯度的同时也可大大减少灭螺剂的实际用量,这样可改善因植物灭螺剂腐烂变质对河流湖泊水质造成的影响[11]。进一步试验寻找、提纯血水草中有效单体成分的意义重大。

试验结果显示CHE能杀灭日本血吸虫尾蚴、防护动物感染血吸虫病,是一种好的植物灭蚴剂。本研究突破性地采用血水草分离提纯后的单体成分-白屈菜红碱为试验药物,开辟了血水草新的用途,同时也为今后进一步研究其他血水草总碱中的单体成分和量化血水草植物杀螺灭蚴剂提供参考依据。

[1]耿辉,徐明星,何昌浩.植物杀螺剂的研究概况[J].实用寄生虫病杂志,2002,10(2):85-87.

[2]曾庆海,程忠跃,黄四喜,等.麻风树素的灭螺效果观察[J].中华中医药杂志,2000,24(3):123-125.

[3]何昌浩,夏国瑾,李桂玲,等.槟榔碱与灭螺药物合用的增效作用研究[J].中国血吸虫病防治杂志,1999,11(4):215-216.

[4]刘年猛,彭飞,黄琼瑶,等.血水草生物碱灭钉螺的初步探讨[J].中国血吸虫病防治杂志,2001,13(5):303-304.

[5]杨华中,黄琼瑶,彭飞,等.血水草生物碱对鱼类毒性实验的观察[J].中国血吸虫病防治杂志,2003,15(4):276-278.

[6]杨华中,黄琼瑶,刘年猛,等.血水草杀螺成分-血水草生物碱(ECA)的提取[J].中国血吸虫病防治杂志,2003,15(6):450-451.

[7]彭飞,黄琼瑶,刘年猛,等.血水草生物碱杀灭日本血吸虫尾蚴预防感染实验的研究[J].中国热带医学,2003,3(6):734-735.

[8]吴征镒主编.新华本草纲要(第1册)[M].上海:上海科技出版社,1988.

[9]何昱,杜方麓.血水草及其主要成分的药理作用[J].中国野生植物资源,1998,17(3):12-15.

[10]彭飞,刘年猛,黄琼瑶,等.血水草生物碱杀灭日本血吸虫尾蚴预防感染的实验研究[J].中国热带医学,2003,3(6):734-735.

[11]Tripathi SM,Singh DK.Molluscicidal activity of punica granatum bark and canna indica root[J].Braz J Med Biol Res,2000,33(11):1351-1355.