HPLC法测定三七止血胶囊中三七总皂苷含量研究

肖 遐 ，阳国平

（1.中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013;2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

三七止血胶囊国家最新批准上市的新药，其处方来源于《金匮要略》、《伤寒论》，由三七和地锦草两味药材组成。本品能止出血、散瘀血、消肿止痛三大功效[1]。维持凝血与抗纤溶动态平衡，有利于止血而不留瘀[2]；抗菌消炎、消肿定痛，有助于伤口早日愈合。因此本品能显著减少出血，减轻疼痛，用于消化道出血、血尿、便血、吐血，血痢，月经不调，人流及产后流血不止，功能性子宫出血，痛经等。血崩，产后血流不止，月经过多及外伤出血。是治疗各种出血和伤科的首选药[3,4]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪；HW2-000色谱工作站。 BO211D电子分析天平(西德Sartorious)；精密度试纸。

1.2 试药

乙腈均为色谱试剂，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。三七止血胶囊：湖南德康制药股份有限公司；三七止血胶囊对照品：三七皂苷R1批号110745-200915,人参皂苷Rg1批号110703-200924,人参皂苷Rb1批号110704-200920(均由中国药品生物制品检定所提供)。

2 含量测定

三七总皂苷是三七止血胶囊中发挥药效的主要化学物质，其含量的多少是决定药效的关键因素，目前三七止血胶囊并没有对应的质量标准，而是借用《卫生部药品标准》中药成方制剂 第十一册中收载的三七止血片的质量标准[5]。但从药代动力学的研究发现三七止血胶囊的吸收和药效作用优于三七止血片[6]，因此没有专门的质量标准这一问题日益严重。需要通过一系列方法学研究得到最准确的三七止血胶囊中的三七总皂苷的含量测定的方法，并且需严格按照《中国药典》2008年版一部附录ⅠL的胶囊剂项下有关的各项规定对样品质量进行检测，以评断其是否合格[7]。

2.1 色谱条件

色谱柱：C18(Alltima 250×4.6mm，5μL);流动相：以流动相A：乙腈，流动相B：水，采用梯度洗脱方式，按下表中的规定进行梯度洗脱：

表1 梯度洗脱流动相成分表

2.2 供试品溶液的制备

取装量差异项下的内容物约1g，精密称定，置于索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流6 h，取甲醇液置水浴上蒸干。残渣加水30mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次（25 mL、20 mL、20 mL、10 mL、10 mL）,合并提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次 25 mL，弃去水洗涤液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性溶液的制备

按处方比例称取除三七以外的其余药味，按制备工艺制成缺三七的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺三七的阴性溶液。

2.4 对照品溶液的制备

分别精密称取三七皂苷R1﹑人参皂苷Rg1﹑人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1mL中含三七皂苷R10.05mg﹑人参皂苷Rg10.2mg﹑人参皂苷Rb10.2mg的混合溶液，即得。

2.5 含量测定法[8]

分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

在上述选定的色谱条件下，供试品色谱中三七皂苷R1﹑人参皂苷Rg1﹑人参皂苷Rb1的峰能与其它组分色谱峰达基线分离，且与其它相邻色谱峰分离度大于1.5；按三七皂苷R1峰计算，理论板数在4000以上；阴性溶液色谱中在与人参皂苷Rb1﹑人参皂苷Rg1﹑三七皂苷R1色谱峰相应位置上无色谱峰，说明阴性无干扰，对照品、供试品与阴性样品的色谱图分别见图 1、2、3。

图1 三七止血胶囊对照品图谱

图2 三七止血胶囊样品测定图谱

图3 三七止血胶囊阴性样品图谱

2.5 .1线性关系的考察

精密吸取浓度为0.0504mg/mL的三七皂苷R1﹑浓度为0.2080mg/mL的人参皂苷Rg1﹑浓度为0.2068mg/mL的人参皂苷Rb1的混合对照品溶液2、6、10、14、18μL 进样，测定其峰面积[20]，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下：

图4 三七皂苷R1对照品标准曲线图

结果表明：三七皂苷R1的回归方程为：y=180232x+3528.5,R2=0.9999，三七皂苷R1在0.1008～0.9072（μg）的进样范围内与峰面积具有良好的线性关系。数据见表2，标准曲线图见图4。

结果表明：人参皂苷Rg1的回归方程为:y=196947x+12308;R2=0.9999，人参皂苷Rg1在0.4160～3.7440（μg）的进样范围内与峰面积具有良好的线性关系。数据见表3，标准曲线图见图5。

表2 三七皂苷R1线性关系考察结果表

表3 人参皂苷Rg1线性关系考察结果表

表4 人参皂苷Rb1线性关系考察结果表

结果表明：人参皂苷Rb1的回归方程为:y=154206x+12641 R2=0.9999，人参皂苷Rb1在0.4136～3.7224（μg）的进样范围内与峰面积具有良好的线性关系。数据见表4，标准曲线图见图6。

图5 人参皂苷Rg1对照品标准曲线图

图6 人参皂苷Rb1对照品标准曲线图

2.5.2 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(20090501)10μL，重复进样5次，测定其峰面积积分值，其结果见表5。

表5 精密度试验结果表

表6 稳定性试验结果表

表7 重现性试验结果表

2.5.3 稳定性试验

分别精密吸取供试品溶液(20090501)10μL，于0、3、6、9、12 h 进样，测定其峰面积积分值，结果见表6。

2.5.4 重现性试验

取同一批号样品(20090501)按上述含量测定方法，测定5次，结果表明，本法重现性好，见表7。

2.5.5 回收率试验

取已知含量三七皂苷R1为1.25mg/g、人参皂苷Rg1为6.76mg/g和人参皂苷Rb1为4.16mg/g（20090501批）样品的内容物，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，分别精密加入三七皂苷R1的浓度为0.1020mg/mL﹑人参皂苷Rg1的浓度为0.4072mg/mL﹑人参皂苷Rb1的浓度为0.3980mg/mL的混合对照品溶液5mL，加甲醇适量，加热回流6 h，取甲醇液置水浴上蒸干。残渣加水30mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取 5 次（25mL、20mL、20mL、10mL、10mL）,合并提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次25mL，弃去水洗涤液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；按含量测定项下的方法测定，计算回收率，结果见下表。

2.5.6 药材的含量测定

参照《中国药典》2008年版一部三七项下的含量测定方法，对三批药材进行了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三者总量进行测定，结果见表11。

为保证药品的质量，规定三七原药材中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三者总量不得低于5.0%。

2.5.7 样品的测定与结果

按上述拟定的含量测定方法测定供试品十批，结果见表 2.12、2.13。

表8 三七皂苷R1的回收率测定结果

表9 人参皂苷Rg1的回收率测定结果

表10 人参皂苷Rb1的回收率测定结果

表11 药材含量测定结果

表13 样品含量测定结果表

结果表明：十批样品含量测定结果的平均值为3.04mg/粒。按平均含量的70%折算，暂定本品限度为：本品每粒含三七以三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的总量计，不得少于2.0mg。

3 讨论

三七止血胶囊中三七为君药,主含总皂苷,约占4%，亦含黄酮类成分。因地锦草和三七中均含有黄酮成分,含量测定如选择黄酮类成份为指标,专属性不强,所以我们选择以三七中的三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1作为控制该制剂含量的检测指标,经方法学考察,本方法准确可行。

三七止血胶囊的质量标准含量测定项可测定三七总皂苷的含量，采用高效液相色谱法测定。色谱柱：C18（Alltima 250×4.6mm，5μL）流动相：以流动相A：乙腈，流动相B：水，采用梯度洗脱方式测定，检测波长：203nm；流速：1.0mL/min。理论塔板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。此方法简便，准确，无阴性干扰。适合收入三七止血胶囊质量标准。

[1]张继,赵朝伟,赵睿.三七的药理作用研究进展[J].中国药业，2003,12(11):76.

[2]王平.三七对血液系统作用的研究进展[J].中国野生植物资源,2000,19(1):10.

[3]苏云明,李占伟,宋春燕,等.三七伤药片抗炎镇痛作用研究[J].中医药学报,1996,(3):52-52.

[4]李琦,叶蕴华,邢其毅.三七水溶性化学成分及其药理研究新进展[J].高等学校化学学报,1996,7(12):18861.

[5]中华人民共和国卫生部.药品标准中药成方制剂 (第11册)[M].1996.91.

[6]李石蓉,刘春祥,黄小兰.活血止痛胶囊的质量标准研究[J].江西中医学院学报,2005,(05):

[7]中国药典.2008年版一部附录ⅥB[M].北京:化学工业出版社.

[8]张力彬,韦建荣.田七花精中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及三七皂苷F的含量测定[J].药物分析杂志,2001,21(5):3101.