MSH5基因C85T多态性与卵巢早衰的相关性分析

夏璐玲，禄婷婷，尹 苹，向跃芸，徐克前

（中南大学湘雅医学院医学检验系，长沙，410013）

卵巢早衰(premature ovary failure,POF)是指在40岁以前出现持续性闭经和性器官萎缩,并伴有卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)及雌激素降低的综合征。POF人群的发病率为1%-3%。POF危害妇女健康,长期低雌激素增加了骨质疏松症、心血管疾病、神经性变疾病的患病风险。同时，POF还可能导致妇女丧失生育能力[1]。近年来,POF的发病率有逐年上升的趋势。约半数以上的POF病因不明,称为特发性POF[2]。很多资料表明,POF有较强的遗传倾向，基因变异或多态性可能是该病发病的重要原因[3]。

错配修复蛋白除了参与DNA的错配修复外，还影响生殖细胞减数分裂中DNA重组的效率和忠实性，其缺陷可致哺乳动物不孕。对减数分裂和错配修复蛋白关系的研究是从MSH4、MSH5的功能研究开始的，目前确定参与减数分裂的错配修复蛋白包括：MSH4、MSH5、MLH1、MLH3 和 PMS2[4]。 有研究报道MSH5基因敲除的雌性小鼠卵母细胞池完全丧失，出生后8-10周还出现了卵巢的退化,最终导致不孕[5]，这些研究揭示MSH5基因在卵巢功能起着重要的作用,MSH5的突变可能会影响卵巢功能，导致POF的发生。本文采用PCR-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RELF）技术，以探讨错配修复蛋白MSH5基因C85T多态性与卵巢早衰的关系。

1 资料与方法

1.1 样本来源

卵巢早衰患者组样本65例，由中信湘雅生殖与遗传专科医院提供 (2009年5月～2010年9月被诊断为卵巢早衰)。卵巢早衰的诊断标准为:女性在40岁以前，出现连续六个月以上闭经,并有两次或以上血清FSH>40 U/L（两次检查间隔1个月以上)。65例患者的染色体核型均为46,XX。通过病史、身体检查、FSH测定结果及辅助检查(甲状腺功能、血糖、抗核抗体及B超等)，未发现发生POF的明确原因。正常对照组样本66例，来自同时期中信湘雅生殖与遗传专科医院已生育妇女，妇科内分泌激素检测及阴道B超检查证实子宫及双侧附件均正常。POF患者年龄在 20～39岁之间，平均（30.7±6.1）岁。 正常对照组年龄在20-39岁之间，平均（30.4±6.3）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要仪器与试剂

Matercycler PCR扩增仪 （德国 eppendorf公司）；PowerPacTM HC型垂直电泳仪，凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；DYY-Ⅲ5稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；引物合成（上海生工公司）；限制性核酸内切酶 Dde I（MBI美国）；血液基因组DNA提 取 试 剂 盒 ，2×Taq PCR Master Mix，50bp DNA Ladder，Marker I（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

所有研究对象均取静脉血4 mL,用EDTA抗凝。3日之内采用血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血白细胞基因组DNA。

1.3.2 MSH5基因C85T多态性检测

1.3.2.1 PCR扩增

引物序列：上游引物：5′-ATCCGCAGAGCCTCCAAG-3′；下游引物：5′-CGCCTCAGTCTCCCAAAG T-3′。 PCR 反应体系 50 μL， 其中 2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上，下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L），基因组 DNA 模板 1.5 μL（250 ng）。 反应采用touchdown PCR:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,68℃退火30 s,72℃延伸30 s,重复5个循环,接着94℃变性30 s,68℃退火30 s,之后72℃延伸30 s,反应每进行1个循环,退火温度下降0.2℃,直到退火温度降到64℃,再继续10个循环,最后72℃5min。此PCR产物的片段为287bp,与已知相对分子量片段的标志物（marker）分别在2%琼脂糖凝胶上电泳，之后观察扩增结果。

1.3.2.2 采用PCR-限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ，PCR-RELF）技术检测MSH5基因C85T多态性

酶切反应：总反应体系为 30μL，包括PCR产物 10 μL，限制性核酸内切酶 Dde I 1μL(10U)，37℃恒温孵育12 h。取酶切后产物经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染观察结果。

1.3.2.3 序列分析验证:

随机抽取30例卵巢早衰患者标本和30例正常对照标本进行测序（(用下游引物进行反向测序)。测序由上海生工公司完成，以验证PCR-RELF技术结果。

1.4 统计学分析

用SPSS 13.0软件进行χ2检验，判断两组基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用χ2检验,比较两组基因型频率和等位基因频率分布。

2 结果

2.1 两组样本PCR产物的结果

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果均显示清晰的287bp条带，见图1。

图1 MSH5 C85T PCR产物电泳图 (M:MarkerⅠ;1-6:287bp扩增片段)

2.2 MSH5基因C85T多态性分析

将POF组和正常对照组PCR产物经Dde I酶切后，发现两组MSH5基因C85T位点处均有碱基C向T的突变（C→T），均有三种基因型，即正常纯合型（CC 型）含 6bp、17bp、31bp、90bp、142bp 五条片段，杂合突变型（CT 型）含 6bp、17bp、31bp、68bp、74bp、90bp、142bp 七条片段，纯和突变型（TT 型）含6bp、17bp、31bp、68bp、74bp、90bp 六条片段，见图 2。

2.3 序列分析验证

对随机抽取的POF和正常对照标本测序，结果与PCR-RELF完全相同(用下游引物进行反向测序)。结果见图2。

图2 PCR-RFLP分析MSH5 C85T RFLP结果

2.4 两组样本MSH5基因的C85T SNP各基因型频率和等位基因频率分布的比较

两组样本的MSH5 C85T基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，说明所选人群具有代表性。POF组样本CC,CT,TT基因型频率与正常对照组比较，差异无统计学意义 （χ2=0.347，P＞0.05）。POF患者组C,T等位基因频率与正常对照组比较，差异无统计学意义（χ2=0.559,P＞0.05）。实验结果列于表1中。

表1 两组MSH5 C85T基因型分布和等位基因频率（%）

图3 POF患者组和正常对照组不同基因型的测序结果

3 讨论

POF是一类高度异质性的疾病,很多原因都可能导致POF的发病，如自身免疫、代谢异常、感染、医源性损伤和遗传等[2]。家族性POF病例的出现支持了该病与遗传因素的密切关系[6-7]。某些基因可能与POF的发生有关，包括了位于X染色体长臂（Xq）的基因及常染色体上的基因。X染色体上三个区域(Xq13-22,Xq26-28和 Xp11.2-22.1)的缺失和易位都与POF有关。许多基因都位于这个三区域内，如 BMP15、FMR1、FMR2。 常染色体上的相关基因有 LHR、 FSHR、INHA、FOXL2等[8]。 不难看出,POF可能是一种潜在的多基因遗传病。

人类MSH5基因包括26个外显子，位于6号染色体P21.3区域，序列全长25kb，其中开放阅读框长2501bp，编码了一个由834个氨基酸残基组成的蛋白，推测的蛋白质相对分子质量为92.2KDa[9-10]。MSH5基因内存在许多编码区域的SNP，很多都是非同义突变，其中至少有7个非同义SNP被识别。相关的SNP改变包括P29S,L85F,Y202C,V206F,R351G,L377F和P786S。Yi等人[11]在对MSH5基因多态性筛查的研究中发现MSH5 C85T错义突变可影响减数分裂。MSH5 C85T可导致MSH5第29号氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸 (P29S)，29号氨基酸位于MSH5与MSH4相互作用的分子域上，MSH5 P29S改变可减弱MSH5与MSH4相互作用，从而影响MSH4、MSH5以MSH4-MSH5异源二聚体的形式参与减数分裂。人类MSH4-MSH5（即hMSH4-hMSH5）异源复合物被认为可能形成一种滑动夹的结构，这种结构可以在减数分裂前期I或在双链断裂修复时稳定和维护Holliday连接点。有学者[12]建立了hMSH4-hMSH5在减数分裂重组的模型，这提示hMSH4-hMSH5异源二聚体从减数分裂的双链断裂修复到交叉形成的调控作用。同时，基因敲除的MSH4和/或MSH5小鼠出现了减数分裂前期I染色体联会的破坏，因此导致不孕不育[5,13-14]。因此，MSH5基因可能对减数分裂I期同源染色体的联会、配对和重组都起着重要的作用。

在胚胎形成时期卵巢中有大约700万个原始卵泡，而大部分在胎儿时期和出生后都相继丢失，妇女一生中总共有400至500个卵泡发育成熟并排出。一个女性生育的年限取决于其卵母细胞的多少和卵母细胞消耗的速度。POF的发病机制可能是:1.原始卵泡的减少；2.正常卵泡闭锁过程加速；3.原始卵泡的成熟障碍[1]。卵母细胞的发育成熟都是通过减数分裂来完成的，其在减数分裂的任何阶段出现问题都会导致不孕不育。而MSH5基因在生殖细胞减数分裂中起到了重要作用。通过对MSH5 C85T基因多态性与卵巢早衰发病的相关性的研究，结果显示MSH5 C85T基因型及等位基因频率分布在卵巢早衰患者组和正常对照组无统计学意义。

卵巢早衰的发生和发展是极其复杂的病理过程，是一种高度异质性的疾病。单纯的一个基因变异或多态性并不一定能导致卵巢早衰的发生，MSH5的基因型频率和C,T等位基因频率在不同种族，群体和个体间分布也存在着差异。虽然本文未证实MSH5基因C85T多态性与卵巢早衰的遗传易感性相关联，但并不能说明MSH5基因多态性与卵巢早衰的发病绝对无关，因为MSH5基因有数个多态性位点，我们只探讨了其中一个，其他的多态性位点是否与卵巢早衰的发病有关，有待进一步研究。全面了解和研究其他的多态性位点与卵巢早衰发病的关系，将会为POF患者提供分子水平上的防治提供新的依据。

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