葡萄糖转运蛋白1和波形蛋白在肺癌胸水中的应用价值

刘 琼，陈雪初，谢丽云，佘宇奇

（1.湖南师范大学第一附属医院，湖南 长沙 410006；2.岳阳市第一人民医院，湖南 岳阳 414000；长沙市血液中心，湖南 长沙 410001）

在胸腔积液中找到癌细胞是诊断恶性胸腔积液的金标准，然而，只有当肺癌病灶浸破脏层胸膜、癌细胞脱入胸腔内才会形成胸腔脱落癌细胞，而从胸膜脱落下来的反应性间皮细胞也有"腺癌细胞"的一些形态特征，加之某些异型性不明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别，故单纯依靠细胞形态学诊断准确性甚低，敏感度仅达57.3%，特异度为89%[1]。葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter-1,GLUT1)广泛存在于人体各组织，是红细胞和上皮细胞的主要表达产物。正常组织中无GLUT1的表达，但在肺、卵巢、结肠等上皮源性恶性肿瘤中，由于肿瘤细胞的无序增生，使葡萄糖转加速代谢来满足生长环境需要，GLUTl急剧增加，是目前应用于研究肺癌热点。波形蛋白(vimentin，VM)是细胞骨架蛋白之一，特异性地分布于间质细胞中，现研究证实：波形蛋白是恶性间皮瘤系的恶性肿瘤标记，是区分肺腺癌恶性间皮瘤的理想指标[2]。本文对肺癌胸水中的GLUT1和VM表达进行探讨。

1 材料和方法

1.1 标本来源

研究用50例胸水标本来自2011年3月～2011年9月湖南省人民医院及湖南省肿瘤医院患者。其中男性31例、女性19例；年龄分布在21～89岁间，中位年龄为50岁。经病理证实，其中肺癌性胸水30例，良性胸水20例，术前均未接受化学、免疫及放射治疗。

1.2 检查方法

收集100 mL胸水，2500 r/min离心10 min，去掉上清，收集沉淀细胞，经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋，连续切片。分别捞取相邻的两片石蜡薄片置病理组织漂烘仪上烘干备用。应用免疫细胞化学-SP染色，检测GLUT1和VM蛋白表达情况。GLUT1和VM蛋白多克隆一抗及兔抗人二抗试剂盒均为即用型。试剂购于福州迈新公司，操作参照说明书进行。

1.3 结果判断

两实验每张切片均随机选择5个完整而不重叠的视野，低倍镜下观察着色的区域，高倍镜下观察细胞膜及胞浆的染色程度。GLUT1蛋白阳性染色定位于胞膜，VM蛋白阳性染色定位于胞浆。双盲法进行阅片。各自以0.01M PBS替代一抗作为阴性对照，用已知多次对照有效的阳性切片作为阳性对照。两种方法的评分标准如下[]：染色程度评分：无着色：－ ；淡黄色：+ ；棕黄色：++ ；棕褐色：+++。

1.4 统计方法

数据统计分析采用SPSS13.0软件包，两组间的比较应用卡方检验，等级相关应用Spearman分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸水细胞GLUT 1免疫细胞化学染色结果

胸水内细胞GLUT 1免疫细胞化学染色结果显示：癌细胞程腺腔样排列，胞膜着色明显，周围间皮细胞和炎细胞不着色，癌细胞GLUT1表达明显，呈棕黄色颗粒外观(图1)。

图1 GLUT1蛋白表达(10×40)

间皮细胞偶有着色，淋巴细胞、粒细胞均不着色。30例肺癌性胸水中有26例癌细胞GLUT 1呈阳性表达，占86.7%。20例良性胸水中只有2例可见间皮细胞着色，占10.0%，皆为胞膜淡浅着色。两种不同性质胸水的GLUT 1阳性率具有显著性差异 (χ2=28.63，P<0.005)，且以肺癌性胸水表达为主。见表1。

表1 两种类型胸水内细胞GLUT 1免疫细胞化学染色结果

2.2 胸水细胞VM蛋白免疫细胞化学染色结果

胸水内细胞VM蛋白免疫细胞化学染色结果：间皮细胞VM蛋白表达明显，胞浆着色，呈棕黄色颗粒外观，周围炎细胞不着色(图2)。

图2 VM蛋白表达(10×40)

癌细胞偶有胞质着色，淋巴细胞、粒细胞均不着色。20例良性胸水中有18例反应性间皮细胞VM呈阳性表达，占90.0%。30例癌性胸水中有3例可见癌细胞着色，占10.0%，皆为胞质着色。两种不同性质胸水的VM阳性率具有显著性差异 (χ2=31.52,P<0.005)，且以良性胸水表达为主，见表2。

2.3 GLUT1和VM在肺癌性胸水中的联合诊断

用 Spearman等级相关分析，rs=-0.506，P=0.019，两者在肺癌胸水中表达呈负相关。两者联合诊断，可提高GLUT1诊断肺癌性胸水的灵敏度，灵敏度为90.0%。结果见表3。

3 讨论

浆膜腔积液常规离心后涂片，发现片面厚薄不均，细胞重叠以及间皮细胞的退变，从而造成诊断困难，而胸水沉积物石蜡包埋切片避免了单一拉片的局限性，切片细胞丰富，易于观察肿瘤细胞的组织学形态，可降低脱落细胞学的误诊风险，从而提高脱落细胞学诊断价值[3]。研究表明肺癌合并胸膜转移为临床常见，约30%的肺癌患者最初的临床表现是胸水性积液[4]，积液中50%由原发性肺癌引起[5-6]。因此，作者通过收集胸水，制成石蜡切块，应用SP免疫组化染色检查GLUT1和VM蛋白在胸水中的表达，以期对肺癌的早期诊断有临床价值。图1和2结果表明，胸水离心沉渣石蜡包埋切片的细胞丰富排列均匀，厚薄一致，细胞结构清晰，背景明亮，有时还能出现组织结构图象。表3和4结果可知，30例肺癌胸水中25例 (86.7%)Glutl阳性，其中6例(+)、11 例(++)、9 例(+++)，其阳性反应物为棕黄色，主要定位于肿瘤细胞的胞膜上，与良性胸水标本比较，二者比较差异均有显著性(P<0.005)；20例良性胸水中 18例(90.0%)VM阳性，其中 4例(+)、8例(++)、6例(+++)，其阳性反应物为棕黄色，主要定位于间皮细胞的胞浆上，与肺癌性胸水标本比较，二者比较差异均有显著性(P<0.005)。表2-5可知肺癌性胸水中GLUT1表达阳性，而VM表达较少，两者联合诊断可提高肺癌性胸水的灵敏度。因此，我们认为胸水中Glutl蛋白的过度表达可能是肺癌发生发展过程中的特征性事件之一，是肿瘤早期诊断和恶化的标志之一，两者联合应用可提高肺癌早期诊断的临床价值。

表2 两种类型胸水内细胞VM免疫细胞化学染色结果

表3 GLUT1和VM在肺癌性胸水中免疫细胞化学染色的联合诊断

[1]Mohanty SK,Dey P.Serous effusions:diagnosis of malignancy beyond cytomorphology.An analytic review[J].Postgrad Med J,2003,79(936):569-574.

[2]张艳梅,付红,张颖.免疫组化在胸膜上皮性恶性肿瘤鉴别诊断中的价值[J].中国肺癌杂志,2007,10(4):320-323.

[3]Zhang JZ,Behrooz A,Ismail Beigi F.Regulation of glucose transport by hypoxia[J].Am J kidey Dis,1999,34(1):189-202.

[4]邱前程,邱善明,黄杰雄.胸腹水细胞块石蜡包埋及免疫细胞化学染色在胸腹水细胞病理学诊断的价值[J].汕头人学医学院学报,2005,18(1):43-44.

[5]Afify A,Zhou H,Howell L,et al.Diagnostic utility of GLUT-1 expression in the cytologic evaluation of serous fluids[J].Acta Cytol,2005,49(6):621-626.

[6]Alatas F,Alatas O,Metintas M,et al.Diagnostic value of CEA,CA15-3,CA19-9,CYFRA 21-1,NSE and TSA assay in pleural effusions[J].Lung Cancer,2001,31(1):9-16.