缺氧环境肝癌SMMC－7721细胞ABCG2和HIF－1α的表达及其关系

卿小松，孔宪炳

（重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 400016）

三磷腺苷结合盒转运体G2（ATP－binding cassette transporter G2，ABCG2）是近年来发现的三磷腺苷结合盒（ATP－binding cassette，ABC）转运体蛋白家族新成员。研究表明，ABCG2参与了多种肿瘤的发生、发展及耐药，并能维持干细胞特性［1－2］。缺氧诱导因子－1α（hypoxia－inducible factor－1alpha，HIF－lα）是目前发现的介导细胞低氧反应最关键的核转录因子，它可促进血管形成，维持细胞氧及代谢平衡，以保证肿瘤生长，并导致化疗耐受［3－4］。本实验研究了在缺氧条件下人肝癌SMMC－7721细胞ABCG2和HIF－1α表达的变化，探索二者表达的关系，并进一步探讨缺氧诱导ABCG2表达的可能机制，为抗肿瘤治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌SMMC－7721细胞株由重庆医科大学普外科学重点实验室提供。RPMI 1640培养基、小牛血清购于Gibco公司；抗HIF－1α多克隆兔抗人抗体购自Santa Cruz公司；抗ABCG2多克隆兔抗人抗体购自武汉博士德公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔第二抗体及增强化学发光（enhanced chemiluminecence，ECL）试剂盒购于碧云天生物技术公司；HIF－lα抑制剂3－（5′－羟甲基－2′－呋喃 ）－1－苄 基 吲 唑 ［3－（5′－hydroxymethyl－2′－furyl）－1－benzylindazole，YC－1］购自Cayman公司；全细胞裂解液及聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自博海生物有限公司。

1.2 细胞培养 SMMC－7721细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中培养，将其分为对照组及缺氧组。对照组在5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞生长至60%汇合状态时，缺氧组细胞放入含1%O2、94%N2、5%CO2混合气体的培养箱培养，根据缺氧时间，缺氧组再分为缺氧24h组、缺氧48h组及缺氧72h组。

1.3 HIF－1α与ABCG2蛋白的检测 收获培养的各组细胞，按照全细胞裂解液说明书提取细胞总蛋白，二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定总蛋白浓度。取50μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，丽春红染色证实转移成功，5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原，第一抗体封闭过夜，第二抗体37℃孵育1h。第一抗体HIF－1α抗体1∶100稀释，ABCG2抗体1∶100稀释，第二抗体工作浓度均为1∶1 000。ECL显影，Bio－Rad凝胶成像系统采集图片，将 HIF－1α与ABCG2灰度值分别与甘油醛－3－磷酸脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）灰度值的比值作为蛋白表达水平的参数，对产物相对定量，实验重复3次。

1.4 YC－1抑制 SMMC－7721细胞 HIF－1α表达后对 ABCG2表达的影响 将缺氧72h组SMMC－7721细胞加入 HIF－1α抑制 剂 YC－1，按 YC－1 终 浓 度 分 为 YC－1 1.0、2.0 及4.0μmol／L组，将不含 YC－1的缺氧72h组SMMC－7721细胞设为YC－1对照组。各组分别处理24h后，采用Western blot检测各组细胞中HIF－1α、ABCG2蛋白的表达。实验重复3次。

1.5 统计学处理 所有数据采用SPSS17.0软件行统计学分析，数据以±s表示，行SNK方差分析及Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 缺氧环境SMMC－7721细胞 HIF－1α、ABCG2蛋白的表达 Western blot结果显示，与对照组比较，在缺氧条件下SMMC－7721细胞中 HIF－1α蛋白表达上调，HIF－1α的表达在缺氧24h时即开始增加，48h稳步上升，72h达到高峰，各缺氧组SMMC－7721细胞HIF－1α的表达与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、表1。ABCG2的表达趋势同HIF－1α的表达，二者表达呈正相关（r＝0.944，P＜0.05），表明随着缺氧的加剧，HIF－1α与ABCG2蛋白表达逐渐增加。

图1 Western blot检测缺氧环境SMMC－7721细胞HIF－1α与ABCG2蛋白的表达

表1 Western blot检测SMMC－7721细胞中 HIF－1α与ABCG2蛋白的表达（±s）

表1 Western blot检测SMMC－7721细胞中 HIF－1α与ABCG2蛋白的表达（±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与缺氧24h组比较；△：与缺氧48h组比较。

组别 HIF－1αABCG2对照组0.184±0.017 0.087±0.017缺氧24h组 0.289±0.044＊ 0.166±0.019＊缺氧48h组 0.385±0.044＊ 0.227±0.034＊缺氧72h组 0.608±0.090＊＃△ 0.344±0.061＊＃△

图2 不同浓度 YC－1对SMMC－7721细胞 HIF－1α、ABCG2蛋白表达的影响

2.2 YC－1抑制 SMMC－7721细胞 HIF－1α表达后对 ABCG2表达的影响 Western blot检测结果显示，随着YC－1浓度的增加，缺氧72h组SMMC－7721细胞中HIF－1α蛋白表达逐渐减少，同时 ABCG2表达亦逐渐下降，除 YC－1 1.0μmol／L组与YC－1 2.0μmol／L组比较，差异无统计学意义外，其余各组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2、表2。

表2 不同浓度 YC－1对 HIF－1α、ABCG2表达的影响（±s）

表2 不同浓度 YC－1对 HIF－1α、ABCG2表达的影响（±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与 YC－1 1.0μmol／L组比较；△ ：与 YC－1 2.0μmol／L组比较。

组别 HIF－1αABCG2 YC－1对照组0.615±0.059 0.509±0.087 YC－1 1.0μmol／L组 0.387±0.054＊ 0.287±0.039＊YC－1 2.0μmol／L组 0.315±0.030＊ 0.239±0.033＊YC－1 4.0μmol／L组 0.085±0.020＊＃△ 0.105±0.019＊＃△

3 讨 论

ABCG2首次发现于乳腺癌 MCF－7／Adr－Vp3000细胞系，因此，又称为乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）［5］。随着研究的深入，人们发现它在多种肿瘤组织及肿瘤细胞中亦有表达［6－7］。ABCG2作为一种转运体，可以将多种化学结构不同的药物“泵出”细胞外，其转运的药物包括：多柔比星、米托蒽醌、长春新碱、紫杉醇及拓扑替康等，其介导的多药耐药（multi－drug resistance，MDR）是导致临床化疗失败的原因之一［8－9］。肿瘤生长快，代谢旺盛，耗氧量大，而肿瘤内部的血管生成则相对较慢，因而缺氧几乎是所有实体瘤微环境的共同特征。缺氧时细胞内亚铁血红素、卟啉类化合物等物质大量堆积，它们可破坏细胞DNA、蛋白质及包膜脂质。此外，缺氧微环境还是造成化疗耐药的原因之一。

赵大伟等［10］发现ABCG2蛋白在正常肝组织及肝硬化组织中均有表达，呈弱阳性。在肝癌组织中，ABCG2表达约2／3呈弱阳性，1／3呈强阳性；ABCG2表达水平与肿瘤直径及数目有关。ABCG2还是肝癌侧群细胞表型的主要因素，后者具有肿瘤干细胞特性，而肿瘤干细胞目前被认为是维持肿瘤生长及化疗失败的根本原因［10－12］。因此，ABCG2可能对维持肝癌生长和化疗耐药发挥重要作用。本研究发现，缺氧环境中SMMC－7721细胞ABCG2的表达较常氧环境中的表达增加，这与Krishnamurthy等［13］的研究结果相符。同时本实验结果还显示，ABCG2的表达随缺氧时间的延长而增加，随着缺氧加剧，细胞能量供求矛盾突出，细胞内糖酵解途径代谢物不断积累，肿瘤细胞上调ABCG2表达以将这些代谢产物排出体外，抵抗缺氧带来的伤害，而由此导致的ABCG2表达增加可能是缺氧下肿瘤细胞耐药的机制之一。

HIF－lα在细胞缺氧信号途径中处于核心位置，它可以促进新生血管形成，维持氧及代谢平衡，以保证肿瘤生长和促进其转移，并引起化疗耐受［3］。本研究发现，在缺氧时SMMC－7721细胞HIF－lα的表达强于常氧环境，并随着时间延长而增加，这表明在持续缺氧条件下，肿瘤细胞可通过上调HIF－lα的表达来维持氧及代谢平衡，促进细胞生长，而这种表达趋势也与相关文献报道一致［14］。

本研究还发现，ABCG2和 HIF－1α在SMMC－7721细胞中的表达水平随着缺氧信号的加强而呈现出一致的增高趋势，且二者表达呈正相关。有关研究显示，HIF－1α可调控40余种基因的表达，诸如MDR1便是其调控的靶基因之一［15］，而MDR1基因编码产物 P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－GP）与 ABCG2同属ABC转运体家族，这就提示ABCG2是HIF－1α的下游目的基因，HIF－1α可上调ABCG2的表达。为了证明这一假设，本研究采用 HIF－1α抑制剂YC－1干预 HIF－1α的表达，发现随着YC－1浓度的增加，HIF－1α的表达水平逐渐下降，更重要的是，ABCG2的表达亦逐渐降低，这表明ABCG2是HIF－1α的相关调控蛋白，缺氧对ABCG2的调控是通过HIF－1α的机制而实现的。

综上所述，缺氧环境中，SMMC－7721细胞ABCG2和HIF－1α的表达上调，并随时间延长而增加，YC－1抑制HIF－1α后可有效下调ABCG2的表达。本实验表明缺氧时SMMC－7721细胞生存及耐药的机制可能是通过缺氧诱导HIF－1α的表达而实现，后者上调ABCG2的表达，增强了肿瘤细胞对缺氧环境的适应能力及化疗抵抗能力。抑制HIF－1α－ABCG2这一途径有望成为治疗肝癌以及逆转肝癌患者耐药的治疗靶点。

［1］ Cascorbi I，Haenisch S.Pharmacogenetics of ATP－binding cassette transporters and clinical implications ［J］.Methods Mol Biol，2010，596：95－121.

［2］ Ding XW，Wu JH，Jiang CP.ABCG2：apotential marker of stem cells and novel target in stem cell and cancer therapy［J］.Life Sci，2010，86（17／18）：631－637.

［3］ Rankin EB，Giaccia AJ.The role of hypoxia－inducible factors in tumorigenesis［J］.Cell Death Differ，2008，15（4）：678－685.

［4］ Rademakers SE，Span PN，Kaanders JH，et al.Molecular aspects of tumour hypoxia［J］.Mol Oncol，2008，2（1）：41－53.

［5］ Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al.A multidrug resistance transporter from human MCF－7breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（26）：15665－15670.

［6］ Ni Z，Bikadi Z，Rosenberg MF，et al.Structure and function of the human breast cancer resistance protein（BCRP／ABCG2）［J］.Curr Drug Metab，2010，11（7）：603－617.

［7］ Ejendal KF，Hrycyna CA.Multidrug resistance and cancer：the role of the human ABC transporter ABCG2［J］.Curr Protein Pept Sci，2002，3（5）：503－511.

［8］ Takahata T，Ookawa K，Suto K，et al.Chemosensitivity determinants of irinotecan hydrochloride in hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2008，102（4）：399－407.

［9］Sharom FJ.ABC multidrug transporters：structure，function and role in chemoresistance［J］.Pharmacogenomics，2008，9（1）：105－127.

［10］赵大伟，殷晓煜，郑进方，等.ABCG2蛋白在肝癌中表达的临床意义［J］.中华消化外科杂志，2010，9（3）：213－215.

［11］Chiba T，Kita K，Zheng YW，et al.Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell－like properties［J］.Hepatology，2006，44（1）：240－251.

［12］Zhang N，Li R，Tao KS，et al.Characterization of a stemlike population in hepatocellular carcinoma MHCC97cells［J］.Oncol Rep，2010，23（3）：827－831.

［13］Krishnamurthy P，Ross DD，Takeo N，et al.The stem cell marker Bcrp／ABCG2enhances hypoxic cell survival through interactions with heme［J］.J Biol Chem，2004，279（23）：24218－24225.

［14］Kizaka－Kondoh S，Tanaka S，Hiroshi H，et al.The HIF－1－active microenvironment：An environmental target for Cancer therapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61（7／8）：623－632.

［15］Cosse JP，Michiels C.Tumour hypoxia affects the responsiveness of Cancer cells to chemotherapy and promotes Cancer progression［J］.Anticancer Agents Med Chem，2008，8（7）：790－797.