白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1、cyclinB1表达影响

季宇彬，孟凡影，曲中原，邹 翔

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076)

白屈菜碱(chelidonine)是从罂粟科白屈菜属植物白屈菜(Chelidonium majus L.)全草中提取分离出的苯并菲啶类生物碱[1]，是白屈菜的有效成分之一.目前发现它除了具有显著的镇痛作用外[2]，还对胃癌、白血病、鼻咽癌、肝癌有抑制作用[3].本文前期研究表明，白屈菜碱对人胃癌SGC-7901细胞生长有抑制作用，并可将其阻滞于G2/M期.本文主要研究白屈菜碱对人胃癌SGC-7901细胞中Cdk1，p-Cdk1(Thr14)和cyclinB1蛋白表达的影响，探讨白屈菜碱诱导SGC-7901细胞发生G2/M期阻滞的分子机制.

1 实验材料

1.1 肿瘤细胞株

人胃癌SGC-7901细胞株，由哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站传代保种.

1.2 药物与主要试剂

白屈菜碱(质量分数98%，深圳美荷生物科技有限公司)，注射用硫酸长春新碱(浙江海正药业股份有限公司).RPMI 1640培养基及胰酶(美国Gibco公司).兔抗Cdk1/Cdc2多克隆抗体、兔抗p-Cdk1/Cdc2(Thr14)多克隆抗体(Bioworld生物技术有限公司)，兔抗cyclin B1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，碱磷酶标记羊抗兔IgG(碧云天生物技术研究所).

1.3 主要仪器

超净工作台(DL-CJ-1N医用型)(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，CO2培养箱(CO-150型)(美国NBS公司)，Adventurer万分之一电子天平(OHAUS公司)，电泳仪(Bio-Rad公司)，垂直电泳转印槽(北京六一仪器厂)，高速低温离心机(美国Beckman-Coulter公司)，Tannon凝胶成像系统GIS-2019(Tannon公司).

2 实验方法

2.1 细胞培养及给药

人胃癌细胞株SGC-7901常规方法复苏后，培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于CO2培养箱(37℃，体积分数为5%的CO2，相对湿度95%)培养.0.25%胰酶消化传代.取对数生长期细胞，设白屈菜碱给药组白屈菜碱(终浓度为6.25、12.5、25μmol/L)，硫酸长春新碱阳性对照组(终浓度为5μmol/L)，阴性对照组(加相同体积的培养液RPMI 1640)，进行后续实验.

2.2 Western Blot法检测白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1，p-Cdk1(Thr14)和cyclinB1蛋白表达的影响

取对数生长期的SGC-7901细胞置CO2培养箱中培养24 h后，加入不同浓度的白屈菜碱和阳性对照药，48 h后弃去培养液，PBS洗2次，用细胞刮刮下细胞.加细胞裂解液，于冰上裂解1.5 h，于4℃下12 000 r/min离心10 min，取离心后的上清，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，分装转移至离心管中放于-86℃保存备用.取蛋白进行电泳，转移到NC膜上，将一抗用5%脱脂奶粉稀释，将膜与一抗置于封闭的塑料袋中在4℃冰箱中孵育过夜.过夜后，TBST缓冲液充分洗膜3次，每次振摇10 min，再与碱磷酶标记羊抗兔IgG室温孵育2 h.冲洗未结合二抗，TBST摇洗3次，每次8 min.膜转移至一浅托盘，室温温育，当蛋白带颜色深度达到要求(约20 min)，去离子水冲洗滤膜.滤纸包住保存，Tannon凝胶成像系统照相.扫描图像在天能GIS凝胶成像分析系统进行量化分析.

2.3 数据处理

上述实验均重复3次.实验结果采用SPSS 16.0进行One-Way ANOVA分析，结果以表示.

3 实验结果

实验结果如图1～3所示，白屈菜碱作用SGC-7901细胞48 h后，可显著下调Cdk1，cyclinB1蛋白的表达(P＜0.01)，同时显著上调p-Cdk1(Thr14)蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01).

图1 白屈菜碱对SGC－7901细胞Cdk1蛋白表达的影响

4 讨论

大量实验表明，白屈菜碱对肝癌HepG-2细胞[4]、白血病L1210细胞[3]、人鼻咽癌KB细胞[5]等均有抑制作用，是一种潜在的肿瘤治疗药物，但其抗肿瘤活性可通过不同途径介导.本文前期研究发现，白屈菜碱可将人胃癌SGC-7901细胞阻滞于G2/M期.

在细胞周期中，细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDKs和细胞周期蛋白cyclins是主要的细胞周期调控分子，其中与G2/M期有关的是Cdk1和cyclinB1.Cdk1是G2/M期的关键蛋白，Cdk1的活化是细胞由G2期进入M期的必要条件[6]，Cdk1上的15位酪氨酸和14位苏氨酸残基使Cdk1高磷酸化，从而抑制了Cdk1的活性引起G2/M期阻滞.而cyclinB1是特异的G2/M期周期素，Cdk1与cyclinB1复合物的活化是启动有丝分裂的关键，同样是G2期进入M期的必要条件[6].而本文研究结果表明，白屈菜碱可显著下调人胃癌SGC-7901细胞中Cdk1和cyclinB1蛋白的表达水平，这样也直接导致了Cdk1和cyclinB1的复合物的减少[7].此外，白屈菜碱还可显著上调人胃癌SGC-7901细胞中p-Cdk1(Thr14)蛋白的表达水平，表明白屈菜碱可使SGC-7901细胞大部分的Cdk1处于磷酸化状态而不能活化，进而将SGC-7901细胞住阻滞于G2/M期，但其更加深入的分子机制尚待进一步研究.

[1]黄 松，杜方麓.罂粟科白屈菜族的化学成分及植物化学分类依据的研究进展[J].湖南中医药导报，2002，10(8):582-584.

[2]何志敏，佟继铭，宫凤春.白屈菜碱镇痛作用研究[J].中草药，2003，34(9):837-838.

[3]韦祖巧，邹 翔，曲中原，等.白屈菜化学成分和药理作用的研究进展[J].中草药，2009，40(S1):38-40.

[4]NOUREINIS K，WINK M.Transcriptional down regulation of hTERT and senescence induction in HepG2cells by chelidonine[J].World JGastroenterol 2009，15(29):3603-3610.

[5]杨秀伟，冉福香，王瑞卿.44种生物碱类化合物对人鼻咽癌细胞株KB和人白血病细胞株HL-60细胞增殖抑制活性的筛选[J].中国现代中药，2007，9(1):8-13.

[6]OBAYA A J，SEDIVY JM.Regulation of cyclin-Cdk activity in mammalin cells[J].Cell Mol Life Sci.，2002，59(1):126-42.

[7]CHEN H，HUANG Q，DON J，et al.Over expression of CDC2/VyclinB1 in gliomas，and CDC2 depletion inhibits proliferation of human glioma cells invitro and invivo[J].BMC Cancer，2008，29(8):1-11.