糖基化反应对蛋清蛋白质凝胶性的影响

孙 强，迟玉杰*，胥 伟

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

糖基化反应对蛋清蛋白质凝胶性的影响

孙 强，迟玉杰*，胥 伟

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

为研究糖基化反应提高蛋清蛋白质凝胶性的机理，利用氨基酸分析仪、苯酚硫酸法、奥氏黏度计、静态激光散射仪对糖基化蛋清蛋白质氨基酸组成、总糖含量、特性黏度、粒径分布进行测定与分析。结果显示：糖基化反应可使蛋清蛋白质的凝胶强度和持水性分别提高91.7%和35.2%，且二者均在反应4d后达到最高值；糖基化处理5d后，蛋清蛋白质的赖氨酸含量相对降低28.42%，总糖含量增至2.18%；特性黏度随反应时间的延长增幅较小；糖基化蛋白粒径分布在0.1～50.0μm之间，糖基化2d内，粒径分布由小粒径峰向大粒径峰转变；糖基化2d后，粒径分布变化不明显。

糖基化；蛋清蛋白质；凝胶强度；粒径分布

蛋清蛋白质(egg white protein，EWP)良好的营养性和多种功能特性使其成为食品工业中重要的成分配料，被广泛用于火腿、腊肠、鱼糜制品及面类制品的生产中。随着食品工业的发展，对具有更高功能特性的蛋清蛋白质的需求极为迫切[1-3]。因此通过各种方法对蛋清蛋白质的功能特性进行改善具有重要的理论意义和实用价值。

利用糖基化反应对蛋清蛋白质进行糖基化修饰是一种安全廉价的改性方法，可以显著改善蛋清蛋白质的多种功能性质。Kato[4]研究表明经糖基化的卵白蛋白乳化性、热稳定性和抗微生物活性都好于未经糖基化处理的卵白蛋白；Jafar等[5]利用高甲氧基果胶与蛋清蛋白质进行接枝反应，结果表明产物的乳化性及乳化稳定性都高于未改性的蛋清蛋白质；Naotoshi等[6]利用半乳甘露聚糖与蛋清蛋白质反应，研究显示改性后的蛋清蛋白质的凝胶强度和持水性均好于未经处理的蛋清蛋白质；于滨等[7]利用葡聚糖对蛋清蛋白质进行糖基化改性研究，实验证明糖基化处理后，蛋清粉的凝胶性、热稳定性、乳化性和起泡性都有显著提高。

虽然前人[4-7]对糖基化改善蛋清蛋白质的功能性质进行了较为深入的研究，但是很少涉及糖基化提高蛋清蛋白质功能性的机理。蛋清蛋白质的凝胶性是一种重要的特性指标。研究糖基化反应对蛋清蛋白质凝胶性的影响，并对改性过程中各组分的变化情况及不同粒径蛋白分子的分布情况进行分析，不仅对进一步研究改性机理具有重要意义，而且对改性蛋清蛋白质的生产加工具有重要的指导价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蛋清粉 市售。

壳聚糖 河北大地生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

ALC-310电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；722-2000型分光光度计 山东高密彩虹分析仪器有限公司；FDU-1100冷冻干燥机 日本Eyela公司；L-8800型氨基酸自动分析仪 日本日立公司；BI-200SM静态激光散射仪 美国布鲁克海文公司；TA-XTplus2质构仪 英国Stable Mic System公司；奥氏黏度计 上海隆拓仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 糖基化蛋清蛋白质的制备

参考于滨等[7]糖基化蛋清蛋白质(glycosylation egg white protein，GEWP)的制备方法，并作部分改动。将壳聚糖与蛋清蛋白质以1:9(m/V)的比例充分混合，配制成10g/100mL的混合样品溶液，冷冻干燥，将制得的混合粉置于装有饱和KI溶液(相对湿度65%)的密闭容器中，60℃保温1～5d，即制得不同反应时间的糖基化蛋清蛋白质。

1.2.2 糖基化蛋清蛋白质凝胶强度和凝胶持水性的测定

凝胶制备：将蛋清粉配制成质量浓度为10g/100mL的溶液，用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl调pH值至7.0，然后取20mL该溶液移入直径32mm体积25mL的烧杯中，用保鲜膜封口，90℃水浴20min，取出后在流水中快速冷却，4℃静置24h待测。

凝胶强度测定：根据Ju等[8]的方法并作部分改动，采用质构仪进行测定，样品测定在25℃进行，仪器条件：采用P0.5探头，测试前速率5.0mm/s；测试速率2.0mm/s；测试后速率2.0mm/s；下压距离10mm；引发力5g。凝胶强度凝胶强度用硬度即探头下压过程中的最大感应力表示。

凝胶持水性测定：根据Choi等[9]的方法，取一定质量(m1)的凝胶体，切成大小均一的小粒，4000r/min离心20min，取出凝胶体用滤纸将表面水分吸干后称质量(m2)，凝胶体持水性按下式计算。

式中：m1为离心前凝胶体质量/g；m2为离心后凝胶体质量/g。

1.2.3 糖基化蛋清蛋白质氨基酸含量测定

根据GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》方法进行测定[10]。

1.2.4 糖基化蛋清蛋白质总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定。将糖基化蛋清粉配制成1g/100mL的水溶液，然后使用透析袋(截留分子质量10000u)透析24h，吸取1mL透析液至试管中，加入6g/100mL苯酚1.0mL混匀，再加5mL浓硫酸，迅速混匀。室温放置5min，然后在沸水浴中保温15min，用水冷却5min，再摇匀，以普通蛋白粉为空白，于490nm波长处测定吸光度，依据标准曲线计算总糖含量。

1.2.5 糖基化蛋清蛋白质特性黏度测定

高分子溶液黏度与分子质量及结构符合Mark-Houwink方程[11]，即[η]=kMα(其中k和α是常数，其值取决于高分子及溶剂的性质和温度等因素)。利用奥氏黏度计测量黏度，25℃恒温水浴，液体流过黏度计毛细管的时间通过精度为0.01s的电子数字秒表计时。每个数据点进行3次重复，每2次实验的差值不大于0.05s，取3次测量的平均值作为最终实验结果。

1.2.6 糖基化蛋清蛋白质溶液粒径分析

参照Schwenke等[12]和Easa等[13-14]的方法，并有所改动。称取0.2g样品，溶于20mL 0.1mol/L pH7.6的磷酸缓冲液中，磁力搅拌使其充分溶解，用静态激光散射仪测定其粒径分布。操作条件：介质水溶液；扫描角度90°；温度25℃；波长632.8nm。

1.2.7 数据分析

糖基化蛋清蛋白质凝胶强度、持水性、特性黏度及总糖含量的测定实验每组重复3次，单因子方差分析通过SPSS V18.0的One-way ANOVA程序进行分析，定义P＜0.05为差异显著，实验结果用Origin8.0绘制成图，图中误差线为样品标准差。

2 结果与分析

2.1 糖基化对蛋清蛋白质凝胶强度和持水性的影响

图1 糖基化蛋清蛋白质凝胶性的变化Fig.1 Change in gel properties of GEWP with reaction time

由图1可知，壳聚糖-蛋清蛋白质糖基化接枝产物的凝胶强度的变化趋势和持水性的变化趋势相一致。糖基化处理1d后，凝胶强度和持水性稍有增强，在处理2～4d后，凝胶强度和持水性显著提高，处理4d后达到最大值，分别由475.374g/cm2和52.6%提高到911.231g/cm2和71.1%，提高幅度分别达到91.7%和35.2%，但处理5d后的样品凝胶强度和持水性开始下降。这可能是由于反应开始时，壳聚糖与蛋白质受热逐步结合使蛋白质结构部分展开，有利于某些基团的暴露，从而使凝胶强度和持水性得到提高。随着反应时间的延长，蛋白质与壳聚糖过度结合，反而使凝胶强度和持水性下降。

2.2 糖基化对蛋清蛋白质氨基酸组成的影响

糖基化作用就是碳水化合物以共价键与蛋白质分子上的α-或ε-氨基相连接而形成糖基化蛋白的化学反应[15]。糖基化蛋清蛋白质氨基酸组成变化对研究糖基化蛋清蛋白质凝胶性和持水性的变化十分重要。糖基化前后蛋清蛋白质氨基酸组成的变化见表1。糖基化后蛋清蛋白质的各种氨基酸均有不同程度的损失，总氨基酸含量由80.02%下降至66.66%，这说明，糖基化作用对蛋清蛋白质氨基酸造成了一定损失。尤其是赖氨酸，其含量相对降低了28.42%，显著高于其他氨基酸损失的平均水平，这与Jafar等[5]的研究一致。造成赖氨酸大量损失的原因可能是赖氨酸的ε-氨基参与了与多糖的糖基化反应。赖氨酸的大量损失会降低蛋清蛋白质的生物有效性，同时也对其营养价值造成损害。然而，通过赖氨酸与壳聚糖的接枝反应，蛋清蛋白质获得了大量的羟基，强化了蛋白质之间的氢键作用，同时吸附了更多的水分子，从而增强了蛋清蛋白质的凝胶强度和持水性。

2.3 糖基化对蛋清蛋白质总糖含量及特性黏度的影响

图2 糖基化对蛋清蛋白质总糖含量和特性黏度的影响Fig.2 Effect of glycosylation on the content of total sugar and intrinsic viscosity of EWP

由图2 可知，糖基化蛋清蛋白质的总糖含量随着处理时间的延长而不断增加。反应1d后，蛋清蛋白质的总糖含量显著(P＜0.05)增加，而在随后的处理中增加不明显，处理3、4、5d样品总糖含量的增加已不显著(P＞0.05)，最终总糖含量增至2.18%。这可能是由于处理1d内糖基化反应进行的较快，生成了大量的糖基化蛋白，而随着反应的进行，反应底物减少，反应的速率降低，糖基化蛋白在体系内积累的速度也随之降低。与未作处理的蛋清蛋白质相比，糖基化蛋清蛋白质的特性黏度都有所上升，并且呈现出随处理时间延长而逐渐增加的趋势。根据Mark-Houwink方程，可以认为在一定温度条件下，糖基化蛋清蛋白质的平均分子质量随糖基化反应的进行不断增大。这可能是不断有多糖分子接枝到蛋清蛋白质分子上，使糖基化产物的平均分子质量不断增加。此外，糖基化反应过程中蛋白质分子形态的改变也可能对增大特性黏度有影响。

2.4 糖基化对蛋清蛋白质分子粒径分布的影响

表1 糖基化对蛋清蛋白质氨基酸组成的影响Table 1 Effect of glycosylation on amino acid compositions of EWP

图3 糖基化蛋清蛋白质粒径分布随时间的变化Fig.3 Change in particle size distribution of GEWP with reaction time

由图3可知，相对于未糖基化的蛋清蛋白质，糖基化蛋清蛋白质的分子粒径发生了明显的变化。糖基化蛋清蛋白质的分子粒径主要分布在0.1～50.0μm范围内。而在此范围内，粒径的分布有明显分为小粒径峰(0.1～1.0μm)和大粒径峰(1.0～20.0μm)。经过1d的糖基化处理，样品的分子粒径向较高的范围内转变，大粒径峰的面积明显增大。反应2d以后这种变化已不明显。2～5d处理的样品粒径分布的峰形已没有明显区别。这说明多糖主要在2d内接枝到蛋清蛋白质上，这与凝胶强度和持水性以及总糖含量的增加相符。

表2 糖基化蛋清蛋白质平均粒径(D[4,3]和D[3,2])Table 2 Mean particle size of GEWP (D[4,3] and D[3,2])

表2列出了不同处理时间糖基化蛋清蛋白质的平均分子直径。其中D[4,3]表征的是体积的直径，D[3,2]表征的面积的直径。可以看出，随着糖基化的进行D[4,3]不断增加，而D[3,2]在处理2d后已没有变化。这可能是因为多糖的链接增加了蛋清蛋白质的体积，但对蛋清蛋白质面积的影响较小。这说明糖基化反应引起了蛋清蛋白质分子形态的变化，验证了上述研究中糖基化蛋清蛋白质特性黏度的变化。

3 结 论

利用壳聚糖对蛋清蛋白质进行糖基化改性，反应4d的改性蛋清蛋白质的凝胶强度和持水性分别提高了91.7%和35.2%；糖基化蛋清蛋白质总氨基酸含量降低了13.36%，其中赖氨酸损失最多，达到28.42%；总糖含量和特性黏度随着反应时间的延长不断增加，但反应2d以后总糖含量的增加不显著(P＞0.05)；糖基化蛋清蛋白质的分子粒径主要分布在0.1～50.0μm的范围内，并分为大粒径峰和小粒径峰，糖基化蛋清蛋白质的粒径分布逐渐由小粒径峰向大粒径峰转变，反应2d后粒径分布变化不再显著。这不但对进一步研究糖基化改性提高蛋清蛋白质凝胶性的机理具有重要意义，同时对改性蛋清粉的加工具有一定的指导价值。

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Effect of Glycosylation on Gel Properties of Egg White Protein

SUN Qiang，CHI Yu-jie*，XU Wei
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The effect of glycosylation on gel strength and water-holding capacity of egg white protein (EWP) was investigated. The change of amino acid compositions, total sugar content, and intrinsic viscosity as well as particle size distribution were detected by amino acid analyzer, phenol sulfuric acid method, and ostwald viscosimeter as well as static laser light scattering instrument. The results showed that gel strength and water-holding capacity of egg white protein were improved after glycosylation. Both of them reached to the highest value after glycosylation for four days, which revealed the improvement by 91.7% and 35.2%, respectively. The content of lysine in egg white protein exhibited a decrease by 28.42% and the content of total sugar revealed an increase by 2.18% at the fifth day during the glycosylation process. Intrinsic viscosity revealed a slight increase as the extension of treatment time. The particle size of the protein was in the range of 0.1－50.0μm and the conversion from small size protein to large size protein was observed at the first two days, and no significant change was observed during the last four days.

glycosylation；egg white protein；gel strength；particle size distribution

TS253.1

A

1002-6630(2012)05-0049-04

2011-04-06

国家自然科学基金项目(30871954)

孙强(1985—)，男，硕士，研究方向为食品化学。E-mail：swsunqiang@163.com

*通信作者：迟玉杰(1963—)，女，教授，博士，研究方向为食品化学及农产品深加工。E-mail：yjchi@126.com