嗜酸乳杆菌对β-乳球蛋白过敏诱发Thl/Th2细胞平衡的影响

李艾黎，孟祥晨,*，徐 渐，邵 红，马冬雪

(1.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

嗜酸乳杆菌对β-乳球蛋白过敏诱发Thl/Th2细胞平衡的影响

李艾黎1，孟祥晨1,*，徐 渐2，邵 红1，马冬雪1

(1.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

目的：观察嗜酸乳杆菌对牛乳β-乳球蛋白(BLG)致敏小鼠Th1/Th2细胞平衡及血清抗体水平的影响，以研究其缓解过敏反应的作用。方法：用牛乳BLG和弗氏佐剂的混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏，建立动物过敏模型。将实验动物随机分为空白组、过敏组与不同剂量的嗜酸乳杆菌组。采用ELISA法测定各组小鼠血清总IgE、BLG特异性IgE和总IgG含量。体外分离培养各组小鼠脾淋巴细胞，采用ELISA法检测细胞上清液中Th1型细胞因子(IL-12、IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4)的水平。结果：中、高剂量嗜酸乳杆菌组小鼠的IFN-γ/IL-4比值(代表Th1/Th2细胞平衡)显著高于过敏组(P＜0.05)；而其血清中的总IgE、BLG特异性IgE和总IgG水平显著低于过敏组(P＜0.05)，与空白组相比无差异性(P＞0.05)。结论：嗜酸乳杆菌干预可改善小鼠的BLG过敏症状，其作用可能与促进Th1占优势的Th1/Th2细胞平衡，阻断IgE及IgG分泌相关。

嗜酸乳杆菌；β-乳球蛋白；牛乳过敏

牛乳β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)被视为最主要的乳过敏原蛋白质之一[1]，能导致Th1/Th2型免疫反应失衡，诱发特异性IgE抗体介导的食物过敏反应[2]，严重影响部分人群对优质乳蛋白的吸收，尤其危及婴幼儿的身体健康[3]。包括注射抗组胺、肥大细胞稳定剂及免疫佐剂等在内的传统治疗方法都具有一定副作用[4]，治疗效果难以令人满意。因此，寻找安全有效的防治牛乳β-乳球蛋白过敏的措施十分必要。

近年来，许多研究学者[5-7]希望能借助乳酸菌来有效减缓过敏反应，并减少药物的使用量。因为许多乳酸菌在肠道中能通过平衡细胞和体液免疫应答，使免疫系统处于健康和稳定的状态。但采用乳酸菌来防治牛乳过敏仍属新兴领域，缺乏相关实验研究数据以及相关作用机制的研究来支持该措施的进一步应用和推广。

本研究基于乳酸菌与抑制食物过敏的发生、发展之间的紧密联系，通过建立BLG致敏动物模型，研究给予嗜酸乳杆菌对致敏模型动物过敏反应的干预作用，为乳酸菌防治食物过敏提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

嗜酸乳杆菌由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室分离保存。

乳清粉 新西兰进口；BCA试剂盒 上海玉博生物科技有限公司；IL-12、IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒 美国R&D公司；总IgE试剂盒 美国Bethyl公司；羊抗鼠IgE酶标二抗 英国AbD Serotec公司；羊抗鼠IgG酶标二抗 中国中杉金桥公司；RPMI1640培养液 美国Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料公司；淋巴细胞分离液 北京Salarbio公司；牛乳β-乳球蛋白标品、弗氏完全佐剂(FCA) 美国Sigma公司。

1.2 动物

雌性清洁级BALB/c小鼠，6～8周龄，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心。饲养环境温度(23±2)℃，相对湿度50%～75%，标准小鼠饲料喂养。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化与菌悬液的制备

嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h后3000×g离心10min收集菌体，用灭菌0.01mol/L、pH 7.4的PBS离心洗涤重悬，调整所得菌悬液浓度约为2×1010CFU/mL。上述菌悬液经100℃、30min热处理后(检验证实无活菌存在，且仍保持正常细菌形态)，冷冻干燥保存备用。

1.3.2 牛乳β-乳球蛋白的制备[8]

以乳清粉为原料，采取高盐低pH值法分离纯化β-乳球蛋白。透析除盐后冻成干粉备用，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度，采用BCA蛋白测定试剂盒(增强型)测定β-乳球蛋白含量。

1.3.3 动物模型的建立[9]

小鼠购进后适应性喂养4d，随机分组(每组8只)，即空白组、致敏组以及嗜酸乳杆菌组。自第1天起，嗜酸乳杆菌组小鼠灌服低、中、高剂量(0.2、1.0、5.0mg)的菌液0.1mL/(d·只)，共28d，空白组同时以等量生理盐水灌胃。致敏组和嗜酸乳杆菌组小鼠在第7、21、28天给予腹腔注射0.2mL 0.5mg/mL的过敏原(1mL弗氏佐剂＋1mL 1mg/mL BLG)，空白组小鼠腹腔注射等量生理盐水。于实验的第30天，即末次腹腔注射48h后检测指标。

1.3.4 ELISA法检测细胞因子[10]

无菌取各组小鼠脾脏，用玻璃针芯在200目筛网上研磨后，加入到RPMI 1640培养液中制成单细胞悬液。加入淋巴细胞分离液进行离心，分离出淋巴细胞，再用RPMI 1640培养液洗涤(4000r/min) 2次。调细胞密度为2×106个/mL。将细胞与含有100mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基及BLG (终质量浓度1g/L)加入到96孔培养板中，每孔总体积200μL，每组设3个重复。在37℃、50mL/L CO2培养箱饱和湿度条件下培养48h后，离心收集上清。严格按照各ELISA试剂盒说明书进行操作，在波长450nm处用酶标仪测定各孔的光密度值，从相应的标准曲线查得各样品的IL-12、IFN-γ、IL-4水平。

1.3.5 ELISA法检测抗体水平[11]

各组小鼠摘除眼球放血，离心后吸取血清，严格按照各抗体试剂盒说明书检测小鼠血清中总IgE、BLG特异性IgE和总IgG含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 11.0软件进行统计分析，各组定量检测数据以x－±s表示，组间比较进行单因素方差分析(Oneway ANOVA)，两两比较采用LSD法；P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌对致敏小鼠Th1/ Th2细胞平衡的影响

表1 嗜酸乳杆菌对BLG致敏小鼠Th1/Th2细胞分泌的影响(±s,n＝3)Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus on Th1/Th2 cell cytokine secretion in BLG sensitized mice (±s,n＝3)

表1 嗜酸乳杆菌对BLG致敏小鼠Th1/Th2细胞分泌的影响(±s,n＝3)Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus on Th1/Th2 cell cytokine secretion in BLG sensitized mice (±s,n＝3)

注：a.与致敏组相比，差异显著(P＜0.05)；b.与空白组相比，差异显著(P＜0.05)。下同。

组别IL-12IFN-γIL-4IFN-γ/ IL-4空白组4.74±0.11623.08±23.3980.34±3.357.75±0.57致敏组4.18±0.10344.87±29.87103.19±4.363.34±0.25低剂量组4.49±0.12543.21±10.51ab77.49±3.81a7.01±0.63a嗜酸乳杆菌中剂量组4.52±0.07608.97±17.34a44.98±5.59ab13.53±0.89ab高剂量组4.61±0.1618.13±12.34a42.61±4.35ab14.50±1.05ab

由于Th1、Th2细胞的比例同IFN-γ和IL-4的分泌水平密切相关，故以IFN-γ/IL-4为代表研究乳酸菌对淋巴细胞Th1/Th2平衡的影响。由表1可知，与致敏组相比，不同剂量嗜酸乳杆菌组小鼠的IL-4质量浓度显著下降(P＜0.05)，而IFN-γ分泌值明显增高(P＜0.05)。由于嗜酸乳杆菌中、高剂量组比嗜酸乳杆菌低剂量组更明显地促进了IFN-γ的分泌(P＜0.05)，使其IFN-γ/IL-4显著高于空白组和过敏组(P＜0.05)。

2.2 嗜酸乳杆菌对致敏小鼠抗体分泌的影响

图1 嗜酸乳杆菌对BLG致敏小鼠血清中总IgE(A)、BLG特异性IgE(B)和总IgG(C)抗体含量的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus acidophilus on serum concentrations of total IgE (A), BLG-specific IgE (B) and total IgG (C) of BLG-sensitized mice

由图1可知，BLG能够诱导小鼠总IgE、BLG特异性IgE和总IgG水平升高，且显著高于空白组(P＜0.05)。用不同剂量的嗜酸乳杆菌干预致敏小鼠后，均能不同程度地降低其血清中抗体的含量，且具有一定的量效关系，差异具有统计学意义(P＜0.05)。特别是中、高剂量嗜酸乳杆菌组更有效地抑制了总IgE、BLG特异性IgE和总IgG的分泌(P＜0.05)，且与空白组相比差异不显著(P＞0.05)。

3 讨 论

研究者多认为Th2细胞占优势的Th1/Th2细胞失衡是过敏发病最重要的免疫学异常[2]：即Th2细胞作为介导体液免疫的重要细胞，其数量增加、功能亢进的最终结果是诱导B细胞产生高水平的IgE应答和嗜酸性粒细胞活化，并引起组胺、白三烯等多种炎性介质释放，导致过敏反应发生。

以往研究表明乳杆菌细胞壁组分可以作为一种主要的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)[12]，例如未甲基化的CpG、肽聚糖(peptidoglycan，PG)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)等[13]，它们被肠上皮细胞或树突状细胞(dendritic cells，DCs)上的Toll样受体家族 (Toll-like receptor，TLRs)识别后，通过TIR区域向胞浆内传导信号，激活NF-κB等转录因子和蛋白激酶[14]，释放细胞因子、表达共刺激分子等[15]，从而激活Th0细胞向不同的亚型细胞分化(如Th1、Th2细胞)，在天然免疫、炎症反应和获得性免疫中发挥作用。本研究中热灭活的嗜酸乳杆菌能诱导致敏小鼠淋巴细胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，使得IFN-γ/IL-4显著升高，促进了Th1型免疫应答，即通过逆转Th2细胞过度亢进来阻断IgE的分泌，这可能是其抑制过敏发生的机理之一。该结果也提示乳酸菌细胞的完整性，而非菌的存活性，可能是其调节淋巴细胞免疫功能的决定因素。

IgG抗体在过敏反应中的作用也日益受到重视，其中IgG4型抗体与食物过敏密切相关，它可吸附于肥大细胞表面而参与病理过程[16]。本研究中BLG的激发亦使过敏组小鼠血清总IgG水平升高，提示嗜酸乳杆菌可能通过下调总IgG分泌量来缓解过敏反应，其具体机制有待进一步研究。

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Effect of Lactobacillus acidophilus on β-Lactoglobulin Induced Mouse Th1/Th2 Cell Imbalance

LI Ai-li1，MENG Xiang-chen1,*，XU Jian2，SHAO Hong1，MA Dong-xue1
(1. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Objective: To investigate the effects of Lactobacillus acidophilus on the Th1/Th2 cell balance and antibody production in bovine β-lactoglobulin (BLG)-sensitized mice and evaluate its efficacy to relieve consequent allergic reactions. Methods: BALB/c mice were intraperitoneally injected with a mixture of milk BLG and Freund,s adjuvant to create BLG-sensitized mouse models. The mice were randomly divided into blank group, allergic group and different dose of Lactobacillus acidophilus group. The total IgE, BLG-specific IgE and total IgG contents in the serum of mice were measured by ELISA. Splenic lymphocytes were isolated and cultured in vitro to detect the levels of Thl type cytokine (IL-12, IFN-γ) and Th2 type cytokine (IL-4) in the supernatant by ELISA. Results: The IFN-γ/IL-4 ratio, which represents the Th1/Th2 cell balance, increased significantly in both middle- and high-dose Lactobacillus acidophilus groups compared to the allergic group (P＜0.05). At the same time, their serum levels of total BLG-IgE and total IgG decreased significantly (P＜0.05), but showed no significant difference compared to the blank control (P＞0.05). Conclusion: Intragastric administration of Lactobacillus acidophilus may be effective in preventing and alleviating BLG allergic symptoms by restoring the Th1/Th2 cell balance to Th1 dominance and by inhibiting IgE and IgG production.

Lactobacillus acidophilus；β-lactoglobulin；milk allergy

R392.12

A

1002-6630(2012)15-0279-04

2011-06-23

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511052)

李艾黎(1978—)，女，副教授，博士，研究方向为乳品微生物及其生物工程。E-mail：aili-mail@163.com

*通信作者：孟祥晨(1970—)，女，教授，博士，研究方向为乳品微生物及其生物工程。E-mail：xchmeng@163.com