曲马多预先给药对急性心肌缺血大鼠心肌P物质的影响

张建文， 郭 政

(1山西大医院麻醉科， 太原 030001;2山西医科大学第二临床医学院麻醉科)

急性缺血性心脏病是严重影响人类健康的疾患之一。传统观点认为，决定心肌缺血、心肌梗死的预后主要取决于心肌缺血的严重程度和持续时间、基础心功能状态、冠状动脉病变程度和心肌缺血的原因［1］。研究表明，急性心肌缺血可诱发大鼠整体心肌组织P物质(SP)表达的增高，提示神经源性机制可能参与心肌缺血的病理学过程［2］。本研究拟观察曲马多预先给药对急性心肌缺血大鼠心肌组织缺血区和非缺血区SP表达的影响，旨在探讨痛觉干预在缺血心肌保护中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器 抗SP抗体、免疫组化及显色试剂盒(北京中山生物技术公司)，SP EIA Kit(Cayman公司，美国)，RNA抽提试剂盒(Qiagen公司，德国)，Taq-DNA聚合酶、AMV反转录酶及PCR标准分子量(Promega公司，美国)，曲马多(批号346G，Crunenthal公司，德国);Leica CM-1850恒冷箱切片机(Leica公司，德国)，IDA-2000数码显微图像分析系统(中国科学院北京空海科技发展有限公司)，PTC-200型 PCR 仪(MJ公司，美国)，GDS-8000紫外凝胶成像系统(UVP公司，英国)，Bio-Red电泳仪(西安海拓普公司)。

1.2 实验分组及心肌缺血模型建立 健康成年雄性SD大鼠18只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重270－300 g，随机分为3组(n=6):假手术组(S组)、单纯结扎冠状动脉组(I组)和曲马多干预冠状动脉结扎组(T组)。大鼠腹腔注射25%的乌拉坦1.2 g/kg麻醉后固定于实验台，气管切开插管行人工机械通气(呼吸频率75次/min，潮气量8 ml/kg)，然后在左侧胸壁第3，4肋间旁开胸骨正中线1 cm处沿肋间开胸，逐层钝性分离暴露心脏，切开心包，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方2 mm处进针，用6－0手术用无损伤线穿过心肌表层肌肉，在肺动脉圆锥旁出针，结扎冠状动脉左前降支(S组穿线不结扎冠状动脉，T组在结扎冠状动脉左前降支前15 min经尾静脉注射人临床使用剂量6.25倍的曲马多12.5 mg/kg)后计时3 h。结扎后心肌变为暗红色，心肌收缩减弱，证明结扎成功，逐层关胸，并行负压引流胸腔。大鼠脱离呼吸机后即刻恢复自主呼吸［3］。

1.3 P物质蛋白水平的免疫组化检测 各组动物在预定时间点开胸快速取动物心脏置于4%多聚甲醛与30%蔗糖混和液(pH7.4)中固定3 h(4℃)，OCT包埋，用Leica恒冷箱切片机做5μm厚连续冠状冰冻切片。采用链菌素亲生物素－过氧化酶连接法(SP法)进行免疫组织化学染色、AEC显色。每组大鼠随机观察缺血区和非缺血区各60个高倍视野(×40)，使用BX51型Olympus显微镜结合IDA-2000数码显微图像分析系统进行SP蛋白水平的平均光度和阳性单位半定量分析。

1.4 P物质蛋白水平的酶免疫法检测 取各组缺血区和非缺血区心肌(缺血区的对侧半球心肌组织)以及假手术组(穿线区和穿线区的对侧半球)心肌组织各100 mg分置于1.5 ml EP管中，加入2 mol/L醋酸后在电热恒温水浴箱95℃加热20 s，用JY92-2D超声波细胞粉碎机匀浆，匀浆液再置于水浴箱90℃加热10 min，20 000×g 4℃离心20 min，取上清液真空干燥后用EIA缓冲液1 ml定容。采用酶免疫法测定SP浓度。

1.5 P物质基因表达的RT-PCR法检测 如上取各组缺血区和非缺血区心肌以及假手术组心肌组织各100 mg分置于1.5 ml EP管中。半定量RT-PCR采用β-actin为内参照，按Qiagen公司总RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA，用紫外分光光度仪测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整性。逆转录反应在0.2 ml EP管中进行，体系为:5×RT缓冲液 6 μl，RNA 酶抑制剂(20 U/μl)0.5 μl，dNTP(10 mmol/L)2.5 μl，AMV 反转录酶(5 U/μl)0.8 μl，随机引物(100 pmol)5 μl，DTT(0.01 mol/L)1.5 μl，RNA 模板6 μl，补充无RNA 酶水至30 μl。逆转录反应条件:42℃50 min，98℃5 min。逆转录反应结束后取5μl产物做PCR，cDNA的PCR引物序列(上海博亚生物技术公司设计合成)如下:SP(252 bp)，上游引物:5'－GAGCCCTTTGAGCATCTTCT－3'，下游引物:5'－ACGCCTTCTTTCGTAGTTCTG－3';β－actin(422 bp)，上游引物:5'－GAGACCTTCAACACCCCAGCC－3'，下 游 引 物:5'－TCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3'。在 25 μl的PCR反应体系中包含MgCl21.5μl，dNTP(10 mmol/L)1.5 μl，Taq-DNA 聚合酶(2 U/μl)1.0 μl，上下游引物各 1.5 μl，缓冲液 2.5 μl，无 RNA 酶水 10.5 μl。扩增条件:95 ℃2 min，94 ℃50 s，50 ℃50 s，72℃1 min，共35个循环后于72℃终延伸10 min。扩增完毕后取5μl PCR产物在溴化乙锭(EB)染色的1%的琼脂糖凝胶上电泳，采用GDS-8000紫外凝胶成像系统进行PCR产物条带扫描及半定量分析。计算目的基因与β-actin条带灰度的比值表示SP mRNA的表达水平。

2 结果

2.1 免疫组织化学结果 阳性免疫反应主要位于心内膜和心肌层的心肌细胞胞质及心外膜血管内皮，缺血区心肌纤维排列紊乱，且可见大量中性粒细胞浸润(见图1，见第237页);免疫组化反应水平以平均光度和阳性单位为指标进行半定量分析，以右室为定位指示，I组大鼠缺血区和非缺血区心肌SP的水平较S组升高(P＜0.05)，T组明显低于I组(P＜0.05)，但高于S组(P＜0.05)，见图2，3。

图1 心肌组织内P物质表达(DAB显色，×400)Fig 1 Expression of substance Pin myocardium of rats(DAB，×400)

图2 P物质免疫组化平均光度分析结果Fig 2 Average light density of substance Pby IH

图3 P物质免疫组化阳性单位分析结果Fig 3 Positive unit of substance P expression by IH

2.2 酶免疫法结果 I组大鼠缺血区和非缺血区心肌SP浓度均较S组升高(P＜0.05)，T组低于I组(P＜0.05)，但高于 S组(P＜0.05)，见图4。

图4 酶免疫法检测P物质表达分析结果Fig 4 Expression of substance P by enzyme immunometric assay

2.3 RT-PCR结果 S组心肌组织内有一定水平SP mRNA表达(见图5)。I组大鼠缺血区和非缺血区心肌SP mRNA的表达较S组增强(P＜0.05)，T组低于 I组(P＜0.05)，但高于 S组(P＜0.05)，见图6。

图5 RT-PCR法检测心肌组织内SP mRNA电泳图Fig5 Expression of substance PmRNA in myocardium by RT-PCR

图6 RT-PCR检测心肌组织内SP mRNA表达分析结果Fig 6 Expression of substance PmRNA in myocardium by RT-PCR

3 讨论

P物质是广泛分布于中枢和外周神经系统具有众多生物活性的神经肽，主要在脊髓背根神经节合成后沿着神经元的中枢突和周围突双方向输送至末梢储存，受到各种刺激(物理、化学、生物)时逆行释放到局部组织中引起血管通透性增强，血浆蛋白外渗，导致神经源性炎症反应。外周组织器官内SP主要来源于器官内感觉神经末梢，但组织中淋巴细胞［4］、嗜酸粒细胞［5］、肥大细胞［6］和单核巨噬细胞［7］也能合成并分泌SP。心肌缺血时感觉神经纤维受刺激后通过轴突反射释放到局部心肌组织的SP可通过以下几方面的作用激发“瀑布式”炎症反应，最终可能使心肌炎症从局部缺血区通过神经机制的介导影响到非缺血区即整体心肌:①促进肥大细胞脱颗粒释放组胺、激肽、趋化因子、前列腺素、IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ 等大量炎症介质，可促进单核细胞分泌 IL-1、IL-6、TNF-α 等炎症因子［8］，可延缓中性粒细胞凋亡［9］，促进中性粒细胞黏附和移行［10］，促进内皮细胞产生黏附分子［11］等;②触发细胞中核转录因子-κB(NF-κB)的激活，继发炎症介质TNF-α、IL-1β 等转录表达增加［12］，TNF-α、IL-1β 反过来又可激活NF-κB，形成正反馈环导致组织发生过度炎症反应和损伤;③促进肥大细胞中TNF-α mRNA 表达和TNF-α 分泌［13］，而 TNF-α 是多器官功能衰竭时激活细胞级联效应、引起过度炎症反应的主要介质［14，15］。牛燕兰等［16］研究表明，心肌内TNF-α表达上调，在急性心肌缺血诱发激活的神经源性反应机制中发挥了重要作用。

痛觉干预是急性心肌梗死治疗中的一项措施，它可通过降低交感神经的过度活动而减轻患者的疼痛和烦躁，削弱神经内分泌压力反应，减少心肌耗氧量。本研究显示，结扎大鼠冠状动脉左前降支3 h，大鼠缺血区和非缺血区心肌SP和SPmRNA的水平明显增加，曲马多干预后均显著下降。其机制可能有:①阿片受体表达于感觉神经元，在脊髓背根神经节合成后通过轴浆运输至感觉神经末梢［17］。外周组织发生炎症后诱导神经细胞轴突内阿片类受体的轴浆转运增强，周围感觉神经末梢阿片受体的数量上调［18］。曲马多与感觉神经末梢的μ1－阿片受体结合后降低心肌感受器对伤害性刺激的敏感性，减少内脏交感传入纤维向中枢传递伤害性刺激以及通过轴突反射引起SP释放，即减少神经源性促炎性因子来源;②曲马多可能直接作用于心肌组织内的免疫炎性细胞使SP的释放减少，即减少了免疫源性促炎性因子来源;③曲马多可能作用于脊髓背根神经节细胞的阿片受体使SP的表达下调;④曲马多还可能通过抑制神经元突触对去甲肾上腺素和5－羟色胺的再摄取，提高其在神经元外水平，激活下行单胺能递质系统的脊髓抑制通路而发挥作用。但其更为确切的作用机制有待进一步研究。

综上所述，曲马多预先给药可明显抑制急性心肌缺血大鼠心肌组织缺血区和非缺血区SP的表达，提示曲马多预先给药痛觉干预可能参与缺血心肌的保护。

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