热休克蛋白32对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织抗氧化能力的影响

师 婷， 宋维芳

(山西医科大学汾阳学院病理生理教研室， 汾阳 032200;*通讯作者，E-mail:65319952@qq.com)

缺血性脑血管病的发病率逐年增高，对缺血缺氧敏感的脑组织需要及时恢复血流再灌注，但是缺血后再灌注引起机体氧化损伤，其后果比缺血本身引起的后果要严重，怎样抑制缺血再灌注的损伤成为焦点。有研究表明［1］，HSP32的高表达有神经保护作用，本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型探讨HSP32在大鼠脑缺血再灌注损伤中的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康SD大鼠36只(山西医科大学实验动物中心提供)，雄性，体重220－250 g，鼠龄3－4个月，随机分为3组:假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)和锌原卟啉IX(Znpp)+缺血再灌注组(Z组)，每组12只。

1.2 主要试剂和仪器 试剂:丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒(均购自南京建成公司);锌原卟啉IX(Znpp，美国Sigma试剂公司)，HSP32兔抗鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司bs-0827R)，仪器:医用氧气罐，微量高速离心机，721可见分光光度计(上海分析仪器总厂)，37℃恒温水浴箱，分析天平(上海第二天平仪器厂)。

1.3 模型制备 制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注入麻醉后，将大鼠俯卧固定，备皮，消毒，参考郑晓影等［2］的方法用右侧颈内动脉尼龙线线栓法致大脑中动脉栓塞(MCAO)，动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉;结扎颈总动脉、颈外动脉;于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线(3－0，ETHICON，Japan)置入颈内动脉17－18 mm，直到有轻微阻力感为止。阻闭120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注。假手术组(S组)麻醉后手术分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，暴露120 min后缝合创口。锌原卟啉(Znpp)+缺血再灌注组在麻醉后腹腔注射Znpp 45 μmol/kg(溶于 DMSO 0.5 ml)，其余操作同缺血再灌注组。

模型成功的标志:①右侧Homer氏征;②左前肢瘫痪。将鼠尾提起，大鼠不能充分伸展左前肢，当动物左旋时其左前肢拖在腹下，与右前肢交叉成剪刀状，行走时向左侧转圈。造模时无上述体征的大鼠不计入实验。假手术组无上述体征［3］。

1.4 标本采集和处理 于再灌注6 h后用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，迅速剪开胸腔暴露心脏，于心尖处剪一小口，插入软管至主动脉，丝线结扎固定，剪开右心耳快速向心脏推注肝素化生理盐水，冲净血液后，以4%多聚甲醛灌流30 min，断头取脑，在冰面上沿大脑纵裂迅速分离两侧大脑半球，右侧1/2大脑半球自视交叉后1 mm处冠状切开，取右脑前脑部分，液氮冷冻后－70℃冰箱保存备用;左侧1/2置4%多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋。

1.5 脑组织检测 将标本置于4%多聚甲醛72 h后石蜡包埋，切片，常规HE染色后，40倍光镜下观察各组脑组织病理学变化。免疫组织化学染色检测组织HSP32蛋白含量变化。光学显微镜下，采用BI-2000医学图像分析系统对免疫组织化学切片结果进行观测，对于HSP32免疫阳性细胞的形态学观

测时以灰度值代表 HSP32蛋白表达，灰度值与HSP32蛋白含量成反比，灰度值越小说明蛋白含量越多，250倍光镜下所见细胞质为棕黄色为阳性细胞。

1.6 MDA含量和SOD活性测定 将标本液氮冷冻后－70℃冰箱保存，匀浆，用考马斯亮蓝蛋白定量。采用硫代巴比妥酸显色测定脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量;嘌呤氧化酶法测定抗氧化酶类超氧化物歧化酶(SOD)活力水平。

2 结果

2.1 各组脑组织病理学变化 HE染色后，光镜下观察可见假手术组神经元数目多，细胞核大而清晰，核仁明显，胞质淡染。Znpp组神经元数目大量减少，细胞核固缩为三角形或多角形，胞质浓染。IR组神经元数目有所减少，少量细胞形态正常，损伤情况介于这两者之间(见图1，见第237页)。

2.2 大鼠脑组织MDA含量和SOD活性的检测由表1可见，与假手术组比较，缺血再灌注组和Znpp组大鼠脑组织匀浆SOD明显下降，MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与缺血再灌注组比较，Znpp组大鼠脑组织匀浆SOD明显下降，MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组脑皮层组织HSP32蛋白表达的变化 各组HSP32蛋白表达的灰度值见表1，缺血再灌注组组显著高于假手术组和Znpp组(P＜0.05)，S组和Z组间无显著差异(P＞0.05)。光镜下免疫组化阳性细胞为棕黄色(见图2，见第238页)。

表1 各组脑组织MDA、SOD和HSP32的比较(±s)Tab 1 Comparison of MDA，SOD and HSP32 in brain tissues among three groups(±s)

表1 各组脑组织MDA、SOD和HSP32的比较(±s)Tab 1 Comparison of MDA，SOD and HSP32 in brain tissues among three groups(±s)

与假手术组比较，*P＜0.05;与缺血再灌注组比较，#P＜0.05

Znpp 组 19.27±1.38*# 30.69±4.66*# 145.80±7.47#

图1 各组脑组织病理学变化(HE染色，×40)Fig 1 The pathological changes of brain tissues in each group(HE，×40)

图2 各组脑组织HSP32的表达，阳性细胞胞质为棕黄色(×250)Fig 2 Expression of HSP32 expression in brain tissues of each group(×250)

3 讨论

脑神经元中能量储备极少，对缺血、缺氧非常敏感，完全缺血很短时间后神经元就会发生不可逆的损害，所以减轻脑缺血再灌注损伤是人们一直致力解决的问题。脑组织自身含有高浓度的不饱和脂肪酸，且需要相对较多的氧供应及脑内相对缺乏抗氧化防御系统，这些特点使得自由基对脑组织的损伤作用显得比较严重［4］。因而脑缺血后，尤其是再灌注期，继发性自由基生成增多是造成神经元损伤的重要因素［5］。MDA是脂质过氧化的最终产物，SOD是体内清除自由基的酶，所以进行组织 SOD和MDA的检测可共同反映机体自由基的生成与清除情况。本实验发现IR组大鼠脑缺血再灌后SOD活性下降，MDA含量上升，说明脑缺血再灌注后机体抗氧化系统受到破坏，自由基生成增多，清除不及时。同时缺血再灌注模型大鼠行为学改变明显，病理学检测也显示神经元有一定程度的损伤，说明模型建立较成功。

HSP32即血红素氧合酶－1(HO-1)，是血红素氧合酶中唯一的一种诱导型酶，其分子量是细胞适应和预防氧化应激反应的一种关键生物学物质［6］。许多研究表明，HO-1高表达具有抗脏器缺血再灌注损伤的作用，但其保护机制尚未完全清楚。目前机制多集中在HO-1降解血红素产生一氧化碳、胆绿素和Fe2+这些代谢产物上，胆红素是胆绿素的还原产物，是机体内天然的强抗氧化剂，可以有效地保护细胞膜拮抗脂质过氧化反应;Fe2+能诱导铁蛋白的合成，后者可减少活性氧的产生［7］;而CO是重要的细胞信号分子，具有抗炎症、抗凋亡及改善微循环等作用［6］。本实验中，用抑制剂Znpp预处理脑缺血再灌注大鼠，HSP32表达降低，与IR组相比，Z组SOD活性下降，MDA含量上升，病理学损伤加重，说明Znpp抑制了HSP32的表达，使得其抗氧化损伤的能力降低，脑组织损伤严重。

综上所述，HSP32可以被缺血再灌注诱导，并且其在脑缺血再灌注损伤中有对抗氧化损伤的作用。

［1］Kusaka N，Sugiu K，Tokunaga K，etal.Enhanced brain angiogenesis in chronic cerebral hypoperfusion after administration of plasmid human vascular endothelial growth factor in combination with indirect vasoreconstructive surgery［J］.J Neurosurg，2005，103:882－890.

［2］Sasaki M，Honmou O，Kocsis JD.A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery［J］.Methods Mol Biol，2009，549:187－195.

［3］郑晓影，赵淑敏，陈萌，等.局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑SOD和MDA的变化［J］.承德医学院学报，2009，26(1):12－14.

［4］Keating DJ.Mitochondrial dysfunction，oxidative stress，regulation of exocytosis and their relevance to neurodegenerative diseases［J］.J Neurochem，2008，104:298－305.

［5］Li Q，Li J，Zhang L，etal.Preconditioning with hyperbaric oxygen induces tolerance against oxidative injury via increased expression of heme oxygenase-1 in primary cultured spinal cord neurons［J］.Life Sci，2007，80:1087－1093.

［6］曾彬，付金蓉，马乐乐，等.血红素氧合酶－1对移植入急性梗死区心肌骨髓间充质干细胞的保护作用［J］.微循环学杂志，2011，21(4):10－12.

［7］Li Q，Li J，Zhang L，etal.Preconditioning with hyperbaric oxygen induces tolerance against oxidative injury via increased expression of heme oxygenase-1 in primary cultured spinal cord neurons［J］.Life Sci，2007，80:1087－1093.