氨基酸部分替代硝态氮对小白菜产量、品质及根际分泌物的影响

曹小闯，吴良欢，陈贤友，韩科峰

(浙江大学环境与资源学院，教育部环境修复与生态健康重点实验室，浙江省亚热带土壤和植物营养重点实验室，杭州310058)

近年来，随着“有机农业”和“有机食品”发展的不断高涨，植物的有机营养问题越来越引起人们的高度重视。研究发现，植物不仅能吸收、同化氨基酸、核酸、磷脂等小分子有机氮化物，而且还能吸收利用如血红蛋白、溶菌酶、核糖核酸酶等高分子有机氮化物［1－2］，其中氨基酸态氮是植物有机氮养分的重要来源。植物能被动分泌且主动吸收根际分泌的有机氮化物［3］，这是植物主动适应环境变化的机制之一。小白菜中含有大量的维生素、矿物质、碳水化合物、维生素等营养物质，是人们日常生活中重要的植物性食品，在现代蔬菜设施栽培中人们为了提高蔬菜产量，盲目施用大量的化学氮肥，导致严重的硝酸盐积累，危害人类健康［4］。已有研究发现，有机氮部分替代无机氮可降低蔬菜硝酸盐含量，然而由于所采用的试验材料及环境条件的不同，特别是在常规培养条件下有机氮尤其是氨基酸态氮易于被微生物分解，很多研究者对已取得的试验结果存在很大的争议［5－6］，对无菌条件下根系分泌物含氮化合物的组成及数量知之不多，且对氨基酸部分替代硝态氮对作物品质、根系结构以及根际分泌物的影响也不甚清楚。本文以双子叶植物小白菜(Brassica chinensis L.)为供试作物，在局部无菌水培条件下研究了单一或混合氨基酸部分替代硝态氮对小白菜的产量、品质以及根际分泌物的影响，以期为蔬菜养分综合高效管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2010年7～9月份在浙江大学华家池校区植物有机营养实验室内进行，供试作物为小白菜(Brassica chinensis L.)，品种为“浙白6号”，试验设4个处理:1)100%硝态氮;2)20%甘氨酸+80%硝态氮;3)20%谷氨酸+80%硝态氮;4)4%甘氨酸+4%谷氨酸+4%丙氨酸+4%脯氨酸+4%天冬氨酸+80%硝态氮，分别记为NO－3、Gly、Glu、AAS，每个处理中总氮的浓度都为12.5 mmol/L，除氮外其它养分配方参考MS培养基的无机盐组成稍加改变而成，其主要成分参见表1。上述无氮营养液采用121℃高压灭菌，硝态氮和氨基酸采用超滤膜灭菌(通过孔径为0.22 μm的微孔滤膜)，然后添加到121℃高压灭菌的无氮营养液中。

表1 无氮营养液中各元素的组成成分(mmol/L)Table 1 Chemical composition of the nutrient solution without N

将小白菜种子于25℃下浸泡12 h后，按照莫良玉等［7］组合灭菌方法进行灭菌，然后将消毒种子播于含约10 mL营养琼脂培养基的培养皿中(直径约为60 mm)，每皿播种子15～20粒，盖上盖用封口膜封好，置于白天温度25℃，夜间温度22℃，空气湿度为60%，光照强度为6000 lux的植培台上发芽，并同时进行菌检。种子发芽后，选取无菌的种子3粒点播于已灭菌且装满琼脂(0.1%)的50 mL塑料离心管(上端有直径0.5 cm小孔的盖)中，并包上已灭菌的玻璃纸，然后置于无菌植培台上，离心管用铝箔包裹，以保证植物根系在黑暗条件下生长，光照和温度条件与发芽时相同，且整个实验期间保持一致。4 d后幼苗从离心管中长出来后去掉玻璃纸，每个离心管保留1株幼苗，然后用南大704硅橡胶密封小孔;7 d后，把苗转移到另一批灭菌且装有50 mL 1/2强度的霍格兰营养液的离心管中，培养7 d后，将营养液更换为处理液，pH为6.0左右，每个处理设15个重复，每支离心管定植1株无菌苗，随机排列，每3 d更换一次营养液，去掉污染幼苗，局部无菌培养24 d后取样测定［8］。

培养24 d后收集根系分泌物，收集后立即加入微生物抑制剂(ampicillin)，用Parafilm密封，然后置于 －24℃冰箱中冰冻保存［9］。

1.2 测定项目与方法

小白菜收获后称重。功能叶片叶绿素含量用SPAD－502叶绿素计测定，以顶端第3、4片叶的叶绿素计读数(SPAD)平均值表示。根系形态用(STD1600，Epson，Nagano，Japan)型根系扫描仪进行测量。小白菜地上部经烘干、粉碎后，用浓H2SO4－H2O2法进行消解，采用半微量凯氏定氮法测定样品的含氮量［10－11］。小白菜新鲜功能叶片游离氨基酸含量用水合茚三酮比色法测定;硝酸盐含量用硫酸－水杨酸法测定;可溶性蛋白用考马斯亮蓝染色法测定，并用牛血清白蛋白作标准曲线;可溶性糖、淀粉含量用蒽酮比色法测定。根系活力用TTC法测定［12］。

幼苗培养24 d后，采用浸根法［13］收集根系分泌物。具体方法:用蒸馏水清洗根部3～5次，再用无菌水清洗，用滤纸吸干根表面水分，然后将根系放入盛有无菌水并包有铝箔的50 mL离心管中，将离心管放入无菌植培台上连续培养收集6 h。根系分泌物的收集、分离所用器具均经高压蒸汽灭菌，然后于60℃条件下抽真空旋转蒸发、浓缩。其中，根系分泌物中硝态氮测定采用紫外分光光度法，铵态氮测定采用靛粉蓝比色法［14］;用TOC仪测定根系分泌物中的可溶性总碳(TC)、可溶性总氮(TN)。可溶性总氮减去无机氮(IN=NO－3+NH+4)含量记为根系分泌物中可溶性有机氮(SON)的含量:即，SON=TN－IN，其中可溶性有机氮分为游离氨基酸态氮(FAAS)和其它可溶性有机氮(包括大分子蛋白质、有机酸、酶类，以 QSON 表示)，即，QSON=SON －FAAS。

1.3 数据处理

数据采用Statistica 5.5(StaSoft Inc，USA)软件进行统计分析，显著性检验采用Daucan’s新复极差法(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 氨基酸部分替代硝态氮对小白菜生长及产量的影响

无菌培养24 d后，与单一硝态氮处理(NO－3)相比，Glu和Gly处理小白菜功能叶片SPAD值显著增大(表2)，分别增加了10.1%和10.4%，AAS处理中SPAD值显著降低，降低了7.1%，叶绿素含量的提高可能是由于外源氨基酸态氮(Gly、Glu)可被小白菜直接吸收利用，并且可以转变为其它氨基酸，如谷氨酸，而谷氨酸是叶绿素合成的底物。氨基酸部分替代硝态氮各处理都显著降低小白菜的地上部和地下部鲜重，各处理地上部和地下部鲜重大小顺序依次为NO－3＞Glu＞Gly＞AAS，干重变化趋势与此相同，Glu处理中小白菜生物量降低幅度最小。不同处理间根冠比都达到了显著性差异，与NO－3处理相比，Gly、Glu、AAS三个处理根冠比分别降低了35.1%、9.5%、23.6%。

2.2 氨基酸部分替代硝态氮对小白菜生理指标的影响

表3看出，氨基酸部分替代硝态氮对小白菜品质的影响因氨基酸种类的不同而异，氨基酸部分替代硝态氮可以在一定程度上改善小白菜品质。Gly、Glu、AAS三个处理显著降低小白菜叶片硝酸盐含量，与NO－3处理相比，分别降低了13.0%、30.0%、15.3%，但Gly和AAS处理间没有显著差异;此外，Gly、Glu、AAS三个处理小白菜可溶性淀粉的含量也都显著降低，其大小顺序为NO3－＞Gly＞AAS＞Glu，且与 NO3－处理相比，分别降低了28.9%、52.9%、47.5%，Glu和 AAS两处理间没有显著差异。

表2 局部无菌水培条件下氨基酸部分替代硝态氮培养24 d后对小白菜幼苗生长的影响Table 2 Effects of partial replacement of NO3－-N by amino acid on the growth of pakchoi seeding after 24 days under the partial sterile hydroponics cultivation

表3 局部无菌水培条件下氨基酸部分替代硝态氮培养24 d后对小白菜生理指标的影响Table 3 Effects of partial replacement of NO3－-N by amino acid on the physiological indexes of pakchoi after 24 days under the partial sterile hydroponics cultivation

值得注意，与NO3－处理相比，Gly、Glu、AAS三个处理提高小白菜可溶性蛋白含量的幅度分别为49.5%、25.6%、31.3%，Gly处理小白菜可溶性蛋白含量达到13.1 mg/g，这可能由于Gly的分子量小，易于被小白菜吸收进而转化为蛋白质有关;Gly、Glu、AAS三个处理小白菜游离氨基酸含量分别提高了63.5%、28.1%、73.1%，AAS处理中游离氨基酸含量最高，达到了347.05 mg/kg，分析原因可能与小白菜对分子态氨基酸(尤其是小分子氨基酸)的吸收同化有关，地下部吸收的分子态氨基酸在根系即经脱氨基、转氨基作用被同化，由代谢产生的各种氨基酸迅速转移到地上部参与蛋白质的合成。Glu处理中可溶性糖含量最高，达到了10.54 mg/kg，相对于NO3－处理，Gly、Glu、AAS处理分别提高了58.1%、128.6%、60.3%;与NO3－处理相比，20%氨基酸部分替代硝态氮(Gly、Glu、AAS处理)显著提高小白菜叶片全氮含量，提高幅度分别为19.6%、9.8%、24.2%;AAS处理中叶片全氮含量最高，达到了43.1 g/kg，说明小白菜能高效利用有机氮。

2.3 氨基酸部分替代硝态氮对小白菜根系形态结构的影响

局部无菌条件下，20%氨基酸态氮部分替代硝态氮对小白菜总根长、根体积、根系活力的影响表现出相同的趋势(表4)，即Glu＞Gly＞NO－3＞AAS，Glu处理促进根毛的生长，根系活力增强，与NO－3处理相比，其根系总根长、根体积、根系活力分别增加28.2%、19.0%、44.9%;相反，AAS处理显著降低了小白菜总根长、根体积和根系活力，分别降低了11.1%、24.3%、25.9%;Gly、Glu、AAS三个处理中根表面积显著降低，分别降低了28.9%、16.4%、35.7%。不同氨基酸部分替代硝态氮对小白菜根系直径影响差异不大，与NO－3处理相比，仅AAS处理根直径显著增大，其它各处理间无显著差异。

2.4 氨基酸部分替代硝态氮对小白菜根系分泌物的影响

表5看出，不同氨基酸处理对小白菜根系分泌物中各组分含量的影响很大。与单一NO－3处理相比，Gly、Glu、AAS三个处理根系分泌物中的硝态氮含量分别降低了19.5%、27.7%、17.1%;相反，20%氨基酸部分替代硝态氮显著提高各处理中铵态氮、游离氨基酸、总有机碳以及总氮的含量，各处理根系分泌物中铵态氮、游离氨基酸、总有机碳和总氮含量的变化趋势均为AAS＞Gly＞Glu＞NO－3，但变幅不等。以游离氨基酸为例，与单一NO－3处理相比，Gly、Glu、AAS三个处理根系分泌物中的游离氨基酸含量分别提高了48.9%、46.2%、122.0%，这说明20%氨基酸部分替代硝态氮能促进根际游离氨基酸的分泌;与NO－3处理相比，Gly、AAS处理都显著提高了根系分泌物中可溶性蛋白含量，分别提高了130.9%，268.3%，但Glu处理与其无显著差异。已有研究指出，根际分泌物成分复杂，含有多种含氮化合物，本试验中无机氮只占总氮的很少一部分(24% ～37%)，大部分(60%以上)以游离氨基酸等有机氮形式存在，且分泌的氨基酸类氮所占比重(约45%)不依替代氨基酸种类的不同而改变(图1)，此时有机氮尤其是游离氨基酸可能充当植物生长环境中的“临时氮库”，可以一定程度上缓解植物对外界氮营养需求。

表4 局部无菌水培条件下氨基酸态氮部分替代硝态氮培养24 d后对小白菜根系形态及根系活力的影响Table 4 Effects of partial replacement of NO3－-N by amino acid on the root morphology and root activity of pakchoi after 24 days under the partial sterile hydroponics cultivation

表5 局部无菌水培条件下氨基酸部分代替硝态氮培养24 d后对小白菜根系分泌物的影响(μg/g，DM)Table 5 Effects of partial replacement of NO－3-N by amino acid on the composition of root exudates of pakchoi after 24 days under the partial sterile hydroponics cultivation

2.5 氨基酸部分替代硝态氮对小白菜根际分泌物不同形态氮含量分配比例的影响

图1 氨基酸态氮部分替代硝态氮培养24 d对小白菜根系分泌物中不同氮含量分配比例的影响Fig.1 Effects of partial replacement of NO3－-N by amino acid on the ratios of different nitrogen contents in root exudates of pakchoi after 24 days of cultivation

小白菜根系分泌物中不同形态氮的含量在氨基酸部分替代硝态氮各处理中表现出明显差异(图1)。本试验中所用营养液无机氮与氨基酸态氮的初始比例为4∶1，但在局部无菌培养24 d后，根系分泌物中的氮形态主要以有机氮为主，NO－3、Gly、Glu、AAS四个处理中有机氮分别是无机氮的1.70倍、2.18倍、2.87倍、3.13倍;与NO－3处理相比，Gly、Glu、AAS三个处理都降低小白菜根系分泌物中无机氮占总氮的百分比，分别降低了5.6%、11.2%、12.8%;NO－3、Gly、Glu、AAS四个处理根系分泌物中的有机氮都以氨基酸态氮为主，其占根系分泌物中总氮的百分比分别为44.26%、43.84%、46.79%、46.16%，各处理间没有显著差异。氨基酸态氮占根系分泌物中总氮的百分比不依所替代氨基酸的种类而有所改变，但影响小白菜根系分泌物中其它有机氮占根系分泌物中总氮的百分比，与NO－3处理相比，Gly、Glu、AAS处理中其它有机氮(比如蛋白质、有机酸、酶类)占分泌物总氮的百分比分别提高了为6.04%、8.62%、10.89%。

3 讨论与结论

已经证实，氨基酸部分替代硝态氮可以明显降低作物体内硝酸盐含量［15］，改善作物品质［16－17］;但也有人发现氨基酸态氮虽能改善作物品质，但却不能提高作物的产量，这与所采用的作物以及氨基酸类型、浓度及培养环境等有关［18］。本试验中小白菜地上部、地下部鲜重或干重，均以NO－3处理最大，进一步说明小白菜属喜硝植物，氨基酸部分替代硝态氮对小白菜的生长发育表现出一定的抑制作用，与前人的研究结果一致［5，19－20］，其中以 Glu 处理降低幅度最低，并且可以显著改善小白菜营养品质，这与葛体达等［20］的研究结果一致，其为开发新型氨基酸有机肥降低小白菜硝酸盐含量提供理论依据。在严格局部无菌条件下避免了微生物对有机氮化物的分解，发现氨基酸部分替代硝态氮提高了小白菜叶片可溶性糖、游离氨基酸、可溶性蛋白和全氮含量，且降低叶片硝酸盐以及可溶性淀粉含量，可一定程度改善小白菜的营养品质。

作物产量的形成是养分供应水平与根际环境条件共同作用的结果，根系的代谢状况直接影响到地上部的生长及其品质的高低［21－23］。大量研究指出，养分缺乏对植物造成生理胁迫，将导致植物生理代谢的异常变化和根系原生质膜透性的增加，同时植物本身也可通过改变根系形态结构、分泌有机物等措施应对环境胁迫［24］。本试验Gly、Glu处理根系形态特征发育良好，尤其是根毛的生长有利于植物对养分的吸收;相反，AAS处理抑制了小白菜地上部和地下部的生长发育，这可能和小白菜根系对不同氨基酸的吸收能力以及氨基酸的化学特性有关，Gly、Ala属于小分子简单氨基酸，植物根系易于吸收转化利用，而Asp、Pro等氨基酸结构复杂、分子量大，小白菜对这些氨基酸态氮吸收能力较弱;此外，氨基酸降低了小白菜叶片硝酸盐的含量，由于植株硝态氮营养水平下降也会抑制小白菜地上部和地下部的生长发育。

已有研究表明，在植物—土壤的“根际对话”(Rhizosphere talk)中，植物起主导作用，根际分泌物起“语言”的作用，禾谷类作物一生中大约有30% ～60%的光合产物转移到地下部，其中有40% ～90%是以有机或无机分泌物的形式释放到根际［25］。当遭受环境胁迫时，植物根系既可以通过释放化感物质(酚、有机酸等)的方式提高植物对氮、磷及金属离子的吸收，提高抗逆性等生理作用，又可以主动吸收根际分泌物［26－27］，增加植物在逆境条件下的相对竞争能力。本研究各处理中小白菜地上部和地下部生物量的变化趋势都为NO－3＞Glu＞Gly＞AAS。根系主要分泌物含量(NH、TN、TOC、FAAS、可溶性蛋白)与小白菜的生物量呈明显的负相关;Gly、Glu、AAS处理中小白菜的地上部生长发育受到一定程度抑制，但其根系活力明显增强，根系分泌物中除硝态氮外各组分含量均显著增加，AAS处理各主要分泌物是NO－3处理的2.13～3.60倍，这似乎说明其根系形态特征以及根系分泌物含量的变化可以在一定程度上缓解小白菜的氮营养胁迫，是小白菜主动适应环境胁迫的机制之一。由于氮的有效性是形成作物产量的主要限制因素，因此其不能从根本上改变小白菜生物量的变化趋势，但通过改变根系形态特征及根际分泌物组成的“根际对话”，提高了根际中养分的循环和生物有效性，在调节其根际环境微生态系统的动态平衡，促进不同生态系统种间、种内物种的共存等方面可能发挥重要作用。

值得一提的是，与NO－3处理相比，本试验中Gly、Glu、AAS处理根系分泌物中有机氮占总氮的百分比分别提高了5.6%、11.2%、12.8%，不同处理中有机氮主要以游离氨基酸的形式存在，因此我们推测在应对外界环境营养胁迫时根系分泌物中氨基酸态氮可能作为植物潜在的“临时氮库”，其重要性应引起人们的重视。此外，氨基酸态氮对小白菜氮素营养贡献率以及根际分泌物中不同形态氮化物的流向等问题有待进一步研究。

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