双菌种制曲改善黄酒麦曲品质的研究*

余培斌，陈亮亮，张波，李国龙，谢广发，蔡国林，陆健

1(江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡，214122)2(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)3(江南大学 生物工程学院，江苏无锡，214122)4(中国绍兴黄酒集团有限公司国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴，312000)

黄酒是以稻米、黍米、玉米、小米、小麦等为主要原料，经蒸煮、加曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成的酿造酒［1］，“以麦制曲，用曲酿酒”是黄酒的特色［2］。麦曲作为黄酒生产的配料，其中含有多种微生物及其代谢产物，给黄酒酿造提供所需的酶，主要是淀粉酶和蛋白酶，淀粉酶把淀粉质原料分解为低分子糖类，为酵母等微生物提供碳源及能量;蛋白酶分解蛋白质成肽和氨基酸等，为微生物的生长、繁殖提供营养物质的同时，也是黄酒中风味物质形成的前体。

麦曲分为生麦曲和熟麦曲，生麦曲采用传统制曲工艺，利用生料，自然接种。麦曲中网罗了多种微生物，形成了特定的微生物群落，所酿的酒口味醇厚，香气较浓，但由于生麦曲是自然培养，曲中主要酶类的活性都较低，在实际生产中用量较大，添加比例约为17%左右，酿造过程中发酵缓慢，残糖高，后续处理时，压榨困难［3］。熟麦曲是在传统制曲的基础上发展起来的新技术，利用熟料，接种纯种米曲霉苏－16进行培养。熟麦曲中淀粉酶活得到了显著提高，但由于菌种单一，酶系简单，所酿的黄酒口味寡淡，杂味较重。因此，改善黄酒麦曲品质，可以考虑多菌种组合制曲。林祖申等采用米曲霉、黑曲霉混合制曲，明显提高酱油质量［4－5］，倪峥飞通过强化从醋醅中分离得到的多株功能微生物，缩短了镇江香醋的发酵周期，同时也提高了香醋中的功能性物质的含量［6］，在研究固态发酵饲料方面，也采用混菌发酵［7－8］。

在前期的研究中，本实验室从黄酒工厂的成品麦曲、原料、曲房、黄酒发酵液、周围空气等多种环境中分离到多株真菌，本文以这些真菌为出发菌株，筛选能够影响麦曲质量的功能微生物，通过生物强化技术，与传统熟麦曲菌种混合发酵，以改善黄酒麦曲的品质，并对制曲条件进行了初步优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

1.1.1.1 斜面培养基

PDA培养基:取去皮马铃薯200 g，切块，加1 000 mL蒸馏水，煮沸20 min后纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL，加葡萄糖20 g，琼脂20 g，pH自然。

1.1.1.2 初筛培养基

产淀粉酶微生物初筛培养基:可溶性淀粉3 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3～5 g/L，NaCl 5 g/L琼脂2% ，pH 7.2～7.4。

产蛋白酶微生物初筛培养基:牛肉膏5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，脱脂奶粉 3 g/L，琼脂 2%，pH 7.0～7.2。

1.1.2 原料与试剂

粉碎小麦由绍兴某黄酒厂制曲车间提供，麸皮购自无锡三里桥农贸市场。菌株自绍兴某黄酒厂环境中分离得到，由实验室保藏。

试剂:3，5-二硝基水杨酸、福林试剂、淀粉、三氯乙酸、酪素、碳酸钠、琼脂粉等，均为分析纯，购自上海国药化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分生孢子悬液的制备

将活化后菌种的分生孢子用无菌水洗入三角瓶中，在超净台上用4层擦镜纸过滤，旋涡振荡均匀，血球计数板计数，孢子浓度调为107个/mL。

1.2.2 高产淀粉酶及蛋白酶微生物的筛选

(1)初筛:取9 cm灭菌过的培养皿，每个加入初筛培养基20 mL，将原有保藏的菌种点植法接种到培养皿中，每皿点种3株霉菌，30℃培养箱培养2～3 d，观察并定期测量菌落周围水解透明圈大小。

(2)复筛:根据初筛结果，从平板中挑选透明圈明显的菌株，做孢子悬液，制作纯种熟麦曲，以糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶酶活为筛选指标，挑选酶活最高者作为目标菌株。

1.2.3 菌种鉴定

(1)菌株形态鉴定。根据文献［9］介绍的方法和分类依据进行初步的分类鉴定。

(2)菌株分子鉴定。染色体DNA的提取、核糖体内转录间隔区(ITS)的扩增和克隆测序:采用文献［10］中的氯化苄法。采用真菌通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)［11］扩增真菌 ITS区域。纯菌株的PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果在NCBI网站进行序列比对。

1.2.4 纯种熟麦曲制曲工艺流程

纯种熟麦曲的制做参考文献［12］中相关章节，结合实验室做曲的特殊情况，将种曲接种改为孢子悬浮液接种。

1.2.5 粗酶液制备

(1)麦曲粗淀粉酶:称麦曲10 g，加入1%NaCl溶液50 mL，30℃恒温水浴1 h，每15 min摇晃1次，滤纸过滤，得粗酶液。

(2)麦曲粗蛋白酶:称麦曲10 g，加入pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液50 mL，30℃恒温水浴1 h，每15 min摇晃1次，滤纸过滤，得粗酶液。

1.2.6 酶活的测定及定义

(1)糖化酶酶活测定:参照方华［13］的测定方法。

酶活定义:1 g干曲经缓冲液提取后的粗酶液，在40℃，pH为4.6的条件下，1 h分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖为1个酶活单位，以U/g表示。

(2)α-淀粉酶酶的测定:采用钝化法测定［14］。

酶活定义:1 g干曲经缓冲液提取后的粗酶液，在60℃，pH 4.6的条件下，每分钟分解可溶性淀粉产生1 mg麦芽糖为1个酶活单位，以U/g表示。

(3)蛋白酶酶活测定:采用福林酚法［15］。

参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活测定法(QB/T 1803－1993)。酸性蛋白酶测定pH为3.0。酶活定义:1 g干曲经缓冲液提取后的粗酶液，在40℃条件下每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个蛋白酶活单位，以U/g表示。

1.3 麦曲培养条件优化

1.3.1 单因素实验

响应面拟合方程只在考察的紧接区域里才能充分近似真实情形，所以要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。结合工厂的实际，分别以培养时间、接种量、原料含水量为因素，以麦曲中蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶酶活为指标，进行单因素实验。

1.3.2 响应面法实验设计

采用Central Composite Design建立数学模型，选用3因素3水平的响应面分析方法，以培养时间、接种量、原料含水量为主要考察因素，合理选择各因素水平，各因素水平及编码如表1所示，利用Design Expert 7.0版本软件对实验数据进行回归分析。该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为:Y

表1 响应面试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 高产淀粉酶及蛋白酶菌株的筛选

实验室保藏的从酒厂中分离得到的微生物(主要为真菌)共121株，经平板初筛，得到能产淀粉酶的菌株为15株，能产酸性蛋白酶的菌株13株，其中有8株菌既能产淀粉酶也能产酸性蛋白酶，将这20株菌做成纯种熟麦曲，测定酶活，进行复筛，得到产较高淀粉酶和酸性蛋白酶酶活的菌株2株，编号为ZW12和 GC3，2株菌与传统熟麦曲所用菌株米曲霉苏－16的酶活比较，见表2。

表2 不同菌株酶活比较

2.2 菌株GC3和ZW12的鉴定

2.2.1 菌株GC3和ZW12的培养形态特征

GC3菌株菌落生长快，在PDA平板上30℃培养24 h后，出现白色菌落，36 h后长满整个平板，菌落蓬松成棉絮丝状，白色菌丝中出现黑色孢子，背面无色。显微观察:菌丝匍匐爬行，假根发达，分枝呈指状或根状，孢囊梗直立，2～4株成束，与假根对生，顶端膨大形成圆形的孢子囊，囊内产生孢囊孢子(见图1)。ZW12菌株菌落生长较慢，在PDA平板上，30℃培养24 h后，出现一小团白色菌落，菌落直径约5 mm，36 h后，菌落变大且中间有白色棉絮突起，约40～60 mm，产生大量黄绿色孢子，背面出现浅浅的橘红色。显微观察发现:分生孢子头放射状，顶囊近球形，分生孢子幼时椭圆形，成熟后为球形或近球形(见图2)。

2.2.2 菌株rDNA的ITS序列分析

对真菌GC3和ZW12的总DNA进行提取，以总DNA为模板，利用真菌通用引物ITSl和ITS4进行PCR扩增得到ITSl—5.8S—ITS2序列，PCR产物大小约为750 bp，对回收纯化的PCR产物进行测序比对，结果表明，GC3的ITS序列同米根霉(Rhizopus oryzae)18S rDNA的ITS序列同源性为100%，真菌ZW12的序列同米曲霉(Aspergillus oryzae)18S rDNA的ITS序列同源性为99%，同时结合形态学分析，将GC3鉴定为米根霉，将ZW12鉴定为米曲霉。

图2 菌株ZW12的宏观及微观形态特征

2.3 制曲菌株及混合比例的确定

将筛选出来的2株菌ZW12，GC3分别与米曲霉苏－16混合制曲，混合时使用孢子悬浮液进行，接种量为每50 g原料接种混合好的孢子悬浮液2 mL，在总接种量不变的情况下，改变混合比例，确定用于制曲的菌株及最优的混合比例，结果见表3。由图3可知在米曲霉苏－16与ZW12混合接种时，随着ZW12在菌种中比例的上升，α-淀粉酶和酸性蛋白酶的酶活呈显著上升趋势，表明菌株ZW12产α-淀粉酶和酸性蛋白酶能力较强，在米曲霉苏－16与GC3混合接种时，随着米曲霉苏－16在菌种中比例的上升，糖化酶酶活呈显著上升趋势，表明米曲霉苏－16产糖化酶较强，米曲霉苏－16与GC3混合接种相对于与ZW12混合接种，糖化酶酶活整体偏高，酸性蛋白酶整体偏低，表明菌株GC3产酸性蛋白酶很弱，这与徐成勇等人的研究结果相一致［16］。综合考虑，选定米曲霉苏－16与ZW12混合为制曲菌种，混合比例为1∶2。

图3 不同菌株不同比例混合接种酶活比较

2.4 单因素实验结果

单因素实验设计中，接种量分别取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，培养时间取 24，28，32，36，42，48，52 h，原料含水量取 45%，50%，60%，70%，80%，90%，试验结果表明最佳培养条件分别为:接种量3.0 mL/50 g原料，培养时间48h，原料含水量80%。

2.5 响应面实验结果

按中心组合设计确定的方案进行制曲实验，具体实验方案以及制曲中糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶活测定结果如表4所示。

表4 CCD设计表及实验结果

2.5.1 制曲各因素对响应值糖化酶酶活的影响

对中心组合实验设计以糖化酶为响应值进行方差分析和回归分析，对各个变量的回归系数和整个模型方程进行显著性检验，具体分析结果见表5。

表5 中心组合设计对糖化酶分析结果

实验结果表明，A(接种量)，B(培养时间)，C(原料含水量)对糖化酶活影响显著。回归模型的P值＜0.000 1，表明模型极显著，对回归系数进行显著性检验，模型变量 B，C，AB，AC，BC，C2高度显著;A，B2也较显著，一次项，二次项都有显著性因素，因此各实验因子对响应值糖化酶的影响不是简单的线性关系。

二次方程的拟合度可由决定系数R2、相关系数R、变异系数CV或者F值来反映。一个具有较好拟合度的二次方程模型，其R2至少为0.8［17］。通常CV值反映模型的置信度，即CV值越低模型的置信度越高。根据Jogleker的研究［18］，模型的 CV值在10以内时，就意味着其置信度较高。仅考虑显著项，制曲过程中各因素对糖化酶的影响可以通过以下多元回归方程进行描述:

糖化酶酶活=1067.18－29.74×A－50.76×B－111.75×C－138.30×AB+56.15×AC－55.78×BC－28.95×B2－58.93×C2

经F值检验显示模型方程高度显著(P＜0.01)，模型的决定系数R2=96.30%，校正拟合度R2(Adj)=92.96%，变异系数CV值为4.27，失拟项不显著，说明模型方程能够很好地反映真实的实验数据。应用响应面分析法，找出了响应变量(糖化酶活)的稳定点，稳定点不是最高值，只是一个鞍点。

2.5.2 制曲各因素对响应值α-淀粉酶的影响

用同样的方法对中心组合实验设计以α-淀粉酶酶活为响应值进行方差分析和回归分析，对各个变量的回归系数和整个模型方程进行显著性检验，模型的P＜0.000 1，说明试验所选用的二次多项模型的模拟度极高。模型中参数 A，C，AB，AC，B2显著，失拟项的P值为0.085 8，无显著意义，说明实验数据中无异常点，无需引入更高次项，模型可行。另外，模型的决定系数 R2=94.48%，校正拟合度 R2(Adj)=89.52%，变异系数CV值2.14，表明该模型可以很好地反映真实的实验数据。

仅考虑显著项，制曲过程中各因素对α-淀粉酶的影响可以通过以下多元回归方程进行描述:

α-淀粉酶酶活 =13.05－0.21×A+0.35×C+0.79×AB－0.24×AC－0.58×B2

应用响应面分析法，找出了响应变量(α-淀粉酶活)的稳定点，稳定点也是一个鞍点。

2.5.3 制曲各因素对响应值酸性蛋白酶的影响

同样对中心组合实验设计以酸性蛋白酶酶活为响应值进行方差分析和回归分析，对各个变量的回归系数和整个模型方程进行显著性检验，模型的P＜0.000 1，说明试验所选用的二次多项模型高度显著。模型中变量 C，AB，BC，A2，C2，B2显著，失拟项不显著，说明实验数据中无异常点，无需引入更高次项，模型可行。模型的决定系数R2=99.20%，校正拟合度R2(Adj)=98.48%，变异系数CV值2.03，符合建立模型的各项标准，所以该模型可以用于解释实验设计及结果。

仅考虑显著项，制曲过程中各因素对酸性蛋白酶的影响可以通过以下多元回归方程进行描述:

酸性蛋白酶酶活=344.51+21.81×C+13.86×AB－19.0×BC－27.39×A2－37.02×B2－20.51×C2

应用响应面分析法找出了响应变量(酸性蛋白酶酶活)的稳定点，此稳定点为最大值。按照得到的数学模型绘制响应曲面图，见图3～图5。

图3 培养时间与接种量的交互作用

图3～图5直观地给出了各个因子交互作用的响应面和等值线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选范围类存在极值，既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。从图中可以直观地看出，接种量、培养时间、原料含水量对酶活都有影响，特别是培养时间与接种量的交互作用影响较大，在响应曲面图中表现为曲面坡度大，变化明显。

图4 原料含水量与接种量的交互作用

图5 培养时间与原料含水量的交互作用

结合回归模型的数学分析可知，制曲最优工艺参数为，接种量2.75 mL/50 g原料，培养时间47.21 h，原料含水量81.01%，此工艺条件下3种酶活理论值分别为糖化酶1 063.1 U/g，α-淀粉酶13.3 U/g，酸性蛋白酶341.5 U/g。

2.5.4 最佳工艺条件的验证

在该模型的最优点处做3次平行试验验证，得到3种主要酶活平均值分别为:糖化酶1 075.4 U/g，α-淀粉酶12.3 U/g，酸性蛋白酶346.7 U/g。可见，基于响应面分析法得到的优化参数准确可靠，具有实际应用价值。

3 结论

(1)对从酒厂分离得到的真菌进行筛选，得到产淀粉酶菌株15株，产蛋白酶菌株13株，其中部分菌株既能产淀粉酶也能产蛋白酶，此研究结果进一步证实，黄酒麦曲的主要水解酶类来源于微生物。

(2)进一步试验表明:米曲霉苏－16与ZW12以1∶2的比例接种时，效果最好。混合菌种最优制曲条件为:培养时间47.21 h，原料含水量81.01%，接种量2.75 mL/50 g原料，培养温度30℃。通过组合双菌株制曲，较传统的米曲霉苏－16单菌种制曲，提高了主要水解酶类的酶活，改善了传统熟麦曲酶系组成，混合菌种制得麦曲的糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶的酶活较传统熟麦曲分别提高了3.5%、77.3%、59.7%。有关这一制曲条件下的成曲对黄酒酿造结果如淀粉及蛋白质利用率、产品风味、黄酒主要成分如总氮、总酸、糖分等的影响，将做进一步的研究。

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