棕榈酰五肽-3的固相合成

王小青，赵红玲，高 杨，王良友，尹志峰

(河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

皮肤真皮中胶原蛋白减少被认为是人体衰老形成皱纹的主要原因，因此，如果能够促进皮肤合成更多的胶原蛋白，那么将会有效逆转衰老从而减少皱纹。小分子多肽类用于抗皱产品已经有很多年[1-2]。每年都有大量多肽类抗皱的产品上市，从早期的乙酰基五胜肽到棕榈酰寡肽。棕榈酰五肽-3(Matrixyl)是棕榈酰寡肽系列抗皱多肽小分子的一种。

Matrixyl中的活性小分子是“微胶原蛋白”，该小分子多肽通过含有Matrixyl的乳膏深入皮肤，到达成纤维细胞。在成纤维细胞合成皮肤连接组织的小分子，如胶原蛋白和蔗糖糖胺，这些合成的分子参与构成皮肤基质[3]。

本研究采用Fmoc固相多肽合成法，用逐步缩合的策略合成了由5个氨基酸以及一个棕榈酸组成的棕榈酰五肽-3，合成路线[3-4]。见附图。

附图 棕榈酰五肽-3合成路线图

1 仪器与材料

1.1 仪器 ALLtechPH426型反相高效液相色谱仪(UV检测器，美国Alltech公司);Newstyle型反相高效半制备液相色谱仪(苏州汉邦科技有限公司);Agilent1200系列高效液相-ESI质谱联用仪(美国Agilent公司);Heal Force系列纯水机(香港力康公司);CHRIST冻干机(北京博励行仪器有限公司);高速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);752型紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司);AR224CN型分析天平(美国奥豪斯仪器上海有限公司)。

1.2 药品与试剂 Wang-Resin(天津南开合成科技有限公司，替代度为1.17mmol/g);3种Fmoc保护基的氨基酸(苏州中科天马肽工程中心有限公司)、棕榈酸(国药试剂有限公司);1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(苏州中科天马肽工程中心有限公司)，N, N-二异丙基碳二亚胺(DIC);哌啶，三氟乙酸(TFA)，苯甲硫醚(国药试剂有限公司)，苯甲醚，乙二硫醇(EDT)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰乙醚和二氯甲烷(DCM)，以上试剂均为分析纯;乙腈(色谱纯，天津科密欧试剂有限公司)，超纯水(实验室自制)。

2 检测方法、制备、裂解与鉴定

2.1 替代度检测方法 精密称取干燥至恒重的AAWang Resin2份，各约8.0mg，分别置于2ml离心管中，加入20%哌啶DMF溶液(V:V)溶液1ml，室温振荡20min，脱去Fmoc保护基。取离心管上清液200μl置于10ml比色管中，DMF 10ml稀释、摇匀，待测。将20%哌啶DMF溶液(V:V)200μl用10ml DMF稀释、摇匀，作为空白对照。于波长301nm处，用紫外分光光度计测定各溶液的吸收值(A)。按照公式 计算替代度，式中，A为测得的吸光度值;51为稀释倍数;Sub为每克树脂中连接的氨基酸的毫摩尔数;ε为Fmoc结构在301nm处的特征吸收值，本实验室校正值6 L(mmol×cm)-1;m为称取的树脂质量(单位为mg)。

2.2 茚检方法 固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，试剂包括:6%茚三酮的乙醇溶液、80%苯酚的乙醇溶液、2% 0.001M KCN的吡啶溶液，配制中的吡啶需要加茚三酮回流，重蒸后再使用。

取少量树脂，加入A、B和C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有蓝色，树脂出现蓝色或红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。

2.3 HPLC-MS 分析方法:色谱条件:色谱柱为Accurasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm);流动相为A:0.1%TFA/H2O，B:0.1% TFA/CH3CN，5%-95%B 梯度洗脱20min，流速为0.2ml/min，检测波长为215nm，样品浓度1mg/ml，进样量10μl。质谱条件:扫描范围100-1200。

2.4 Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin的制备把1.71g Wang Resin投入到反应柱中，DMF洗涤一次，抽干;用适量干燥二氯甲烷常温溶涨，N2吹拂搅拌30min至树脂充分溶胀，抽干液体;DMF洗涤一次，抽干;重蒸DMF洗涤一次，抽干。加入3.07g Fmoc-Gly-OH、1.30g HOBt、1.49ml DIC的DMF/DCM(1:1)溶液5ml。反应5min后，加入0.10g DMAP，反应4h。反应结束后，抽干反应液，用DMF洗涤三次抽干，取出少许树脂进行替代度检测。随后加入200ml封闭试剂(AC2O/吡啶(7:6，V:V))，反应8-16h，DMF洗涤2次;无水甲醇洗两次(10min/次)，真空减压干燥至恒重。测得Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin的替代度为0.71mmol/g。

2.5 Matrixyl-Wang Resin的 制 备 ① 在Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin反应柱中，加入DCM溶涨20-30min，抽掉。加入DBLK溶液(哌啶/DMF(V/V)=1:4)脱保护2次(5+10min)，两次脱保护之间需加入DMF洗涤1min，抽掉。两次脱完保护抽掉后再用DMF，甲醇，DCM，DMF，各洗涤1次，用玻璃棒挑取少许树脂，茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。②在脱保护的过程中，称取2.93g Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.81g HOBt置烧杯中，加入2ml精制DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入0.93ml DIC于溶液中活化8min，若出现白色絮状泡沫表明活化已完全，用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入DMF于反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现，若出现挂壁，用少许精制DMF将壁上的树脂冲到反应液中。室温反应2h，茚检合格后可抽掉反应液继续连接下一个氨基酸。

2.6 Matrixyl-Wang Resin的裂解 将干燥至恒重的Matrixyl-Wang Resin0.10g置于玻璃烧瓶中，冰浴搅拌下加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-EDT(体积比95:5:3:2)4ml，反应30min，逐渐升至室温，于室温下反应2h。过滤，用少许TFA洗涤树脂，将滤液倾入40ml无水冰乙醚中，析出白色固体，4000rpm离心4min，弃去上清液，重复2次，真空干燥，得粗肽46.6mg。

2.7 Matrixyl粗肽的分析鉴定 粗品Matrixyl进行RPHPLC分析，纯化后Matrixyl的HPLC-ESI-MS分析可知其m/z 402.3{[M+H]2+}，Matrixyl的分子量为802.05，理论值与实际值相符。

3 讨论

棕榈酰五肽-3为短肽，为提高最终产量，应尽可能提高替代度。本研究对反应时间、缩合试剂以及氨基酸比例等多种因素进行优化，最终使替代度达到0.71mmol/g，相当于替代86.6%。

本研究对棕榈酰五肽-3 的裂解试剂进行了优化，对几种裂解液配比进行了比较，结果发现TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-EDT(体积比95:5:3:2)配比裂解后纯度高，杂质少，易于纯化，使本次实验能够得到纯度较高的棕榈酰五肽-3，为棕榈酰五肽-3的固相合成研究提供一种可行的方法。

[1] 李校坤,姚成灿,黄亚东,等.生物活性多肽护肤品的基础及应用[J].日用化学工业,2002,32(5):41-44.

[2] 钟星,郭建维,成秋桂.胜肽在化妆品中的应用和最新进展[J].日用化学品科学,2012,35(11):35-38.

[3] Fields K,Falla TJ,Rodan K,et al.Bioactive peptides:signaling the future[J].Cosme Dermatol,2009,8(1):8-13.

[4] 王德心.活性多肽与药物开发[M].北京:中国医药科技出版社,2011.442.

[5] 厉保秋.多肽药物研究与开发[M].北京:人民卫生出版社,2008.51-67.