水稻E3泛素连接酶研究进展

戴阳朔，董 铮，李 魏，戴良英

(湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128)

泛素—蛋白酶体途径(ubiquitin－proteasome pathway，UPP)广泛存在于真核生物中，主要包括泛素化系统和26S蛋白酶体系统两部分。该途径在维持细胞功能，细胞周期运转，胚胎发育，激素响应，抵御环境胁迫和衰老等方面发挥着重要的作用。在泛素化系统中，关键酶主要包括泛素活化酶(Ubiquitin－activating enzyme，E1)、泛素结合酶(Ubiquitin －conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶(Ubiquitinprotein ligase，E3)。该系统对维持细胞内蛋白质的产生和降解的平衡及维持细胞的稳态和正常功能方面起着重要作用。该系统一个重要的特点就是E1s、E2s、E3s的数量存在很大的差异。在拟南芥中，约1 400个基因(占总蛋白质数量的5%左右)编码泛素化系统的组分，其中E1基因只有2个;E2基因有37个，E2－like基因8个;E3基因超过1 400个［1］。在水稻中E1基因有6个，E2及 E2－like基因有49个，而E3基因则超过1 300个［2］。这可能主要是由于在泛素化系统中，E3的功能主要是特异性地识别不同的泛素化底物。近年来，拟南芥中E3在调控生长发育以及应对逆境胁迫等方面的研究取得较大进展，而E3在水稻中的研究尽管也取得了一定进展，但相对缓慢。本文在简单概述泛素E3连接酶结构的基础上，主要对近年来水稻中E3连接酶介导的生物学功能进行综述。

1 E3泛素连接酶的结构特点与分类

E3泛素连接酶是一个超大的蛋白家族，其在整个泛素蛋白质降解途径中决定底物特异性的部分。根据E3的结构组成，它可以分为单亚基E3和多亚基 E3 两大类［3］。

单亚基的E3主要有两类:一类含有HECT(homologous to the E6－AP carboxyl terminus)结构域，一类含有RING/U－box结构域［4］。HECT结构域长约350个氨基酸残基，N端与E2结合，距C端约30个氨基酸残基处有一个与泛素形成硫脂键的半胱氨酸位点［5］。含有HECT结构域的E3广泛存在于植物中，但在水稻中目前还没有对其功能研究的报道。单亚基RING型E3是一类含有RING－finger结构域的蛋白。RING finger结构域是指70个氨基酸中由半胱氨酸(C)和组氨酸(H)组成的8个氨基酸通过与锌离子螯合作用形成C3H2C3(RINGH2)或 C3H1C4(RING － HC)构型［6］。U －box结构域则是通过静电的作用形成一种与RING finger结构域类似的构型，使得其结构比RING finger结构域更保守和稳定［7］。两者由于结构上相似，在泛素蛋白质降解途径中起着类似的功能。

多亚基的E3主要有APC(Anaphase Promoting Complex)、SCF(Skp－Cullin－F－box)和 VBC(VCB－Cul2 complex)复合体，它们都含有一个支架蛋白Cullin(或Cullin－like)和一个RING－finger蛋白。在植物中研究得比较深入的主要是SCF复合体，例如 SCFTIR1、SCFCOI1、SCFEBF1/EBF2［8～10］等。SCF 复合体包含SKP1、Cullin和F－box三个蛋白，SCF与一个有RING－finger结构域的蛋白和一个小分子蛋白RUB1共同作用组成E3［11］。在SCF复合体中，Cullin作为支架蛋白结合RING－finger蛋白和连接蛋白SKP1，SKP1则结合一系列具有底物特异识别功能的F－box蛋白［12，13］。随着越来越多的新型 E3被发现，理解其功能发挥的作用机制已成为当今研究的重要方向。

2 水稻中单亚基RING E3的生物学功能

在真核生物中，RING－finger蛋白是一个庞大的家族，大部分具有E3连接酶的活性。RING－finger蛋白被认为在介导泛素转移特异性底物方面具有重要作用，参与各种翻译后调节过程，如蛋白降解、蛋白功能和结构改变、蛋白定位变换等［6］。单亚基RING E3的RING －finger结构域负责结合E2，其他的结构域则负责结合靶标蛋白和一些其它的辅助因子。在植物中，如模式植物水稻和拟南芥中，已知的RING－finger蛋白分别至少有425和469个［14］。目前水稻中已经研究发现的E3以单亚基RING型居多，这些已发现的单亚基RING E3在水稻的抗病、抗非生物胁迫及生长发育等方面起重要的作用。

2.1 单亚基RING E3介导的水稻抗病反应

Xb3是水稻白叶枯病正调控因子Xa21的一个互作蛋白，其 N端含有8个重复的锚蛋白结构域［15］，C端含有1个 RING －finger基序，这两个结构的功能分别是与Xa21激酶结构域结合和发挥E3泛素连接酶活性。Xa21蛋白不是通过Xb3的泛素化途径降解，Xb3对于维持 Xa21蛋白稳定性和Xa21介导的抗病反应是必需的。当病原菌侵染的时候，Xb3与Xa21形成复合体通过磷酸化作用将Xb3激活，被激活的Xb3可能通过泛素化降解抗病反应中负调控因子，从而激活下游的抗病信号蛋白。

OsBBI1是一个表达受稻瘟病菌(Magnaporthe Oryzae)诱导的 RING－finger类型 E3泛素连接酶［16］。OsBBI1正调控稻瘟病抗性反应，OsBBI1过表达植株提高了对稻瘟病的抗性。在接种稻瘟病菌后，OsBBI1过表达植株的叶鞘表皮细胞壁厚度比对照大，细胞壁合成相关基因的表达量上升，说明OsBBI1可能通过改变细胞壁抗性反应在抗稻瘟病过程中起作用。

2.2 单亚基RING E3介导的水稻非生物胁迫反应

OsDSG1是一个从种子延迟萌发的T－DNA突变体群体中鉴定出来的RING－finger类型E3泛素连接酶［17］。与野生型相比较，除了延迟种子萌发外，osdsg1突变体对高盐和干旱胁迫的耐受性增强。在osdsg1突变体中，一系列ABA信号途径基因和ABA响应基因的转录水平显著升高，说明OsDSG1可能是依赖于ABA信号途径来负调控干旱和高盐等逆境胁迫响应过程。

OsDIS1是从干旱处理的水稻芯片数据中分离出来的RING－finger类型E3泛素连接酶。相比对照，OsDIS1过表达削弱了水稻对干旱的抗性，而该基因的RNA干扰却增强了水稻对干旱的抗性。在正常和干旱条件下，OsDIS1过表达植株中大量逆境胁迫应答基因和调节因子被诱导或抑制表达［18］。此外OsDIS1与OsNek6存在相互作用，且OsDIS1可在体外泛素化OsNek6［19］。说明OsDIS1可能通过在转录水平调控一系列逆境相关基因的表达，及翻译后修饰OsNek6来负调控水稻的干旱胁迫响应过程。

水稻OsSDIR1是拟南芥ABA信号正调控因子SDIR1的同源蛋白，是一个RING－finger类型的E3泛素连接酶［20］。OsSDIR1能够互补拟南芥sidr1突变体对干旱敏感的表型，且过表达OsSDIR1的拟南芥植株对ABA更加敏感。与对照相比，干旱处理下过表达OsSDIR1的水稻植株中气孔关闭的比例增加，叶片失水速率减慢，表现出较强的干旱耐受性。说明OsSDIR1可能与SDIR1相似，通过介导ABA信号转导途径正调控水稻干旱胁迫响应过程。

Rma1H1是辣椒中一个RING－finger类型的泛素E3连接酶，通过泛素化修饰水通道蛋白PIP2;1，正调控植物干旱胁迫反应［21］。Bae等［22］采用同源克隆的方法分离出Rma1H1在水稻中的一个同源基因OsRDCP1，该基因也编码一个RING－finger类型的泛素E3连接酶。与对照相比，OsRDCP1过表达植株在严重干旱的情况下表现出较强的干旱耐受性，说明OsRDCP1蛋白是一个水稻干旱胁迫响应过程正调控因子。

2.3 单亚基RING E3介导的水稻其他生物学过程

GW2是通过图位克隆的方法得到的一个影响稻谷的粒宽和粒重的 QTL［23］。水稻品种 FAZ1中GW2蛋白含有425个氨基酸;而水稻品种WY3中GW2等位基因由于第4个外显子上一个碱基的缺失，使其蛋白翻译提前终止，编码的产物只有115个氨基酸，缺失的部分为锚蛋白结合位点。这两个等位基因都具有完整的RING－finger结构域和E3泛素连接酶活性。与FAZ1相比，WY3由于GW2功能缺失使其底物不能被特异识别，进而激活颖花外壳细胞的分裂，从而增加颖花外壳的宽度;另一方面，间接地提高了灌浆速率，胚乳的大小得到增加，最终使得粒宽和粒重增加，产量提高。这说明GW2通过负调控细胞的分裂控制水稻粒型及产量。

3 U－box类型E3介导的生物学过程

植物中广泛存在 U－box基因，拟南芥中有64个U－box蛋白［24］，而水稻中有 77个 U－box蛋白［25］。U－box蛋白构象与RING－finger蛋白极其相似，两者都能促进底物蛋白泛素化降解，在细胞内异常蛋白的降解及质量控制方面发挥着重要的作用。现有一些报道证明U－box蛋白也在水稻抗非生物胁迫和抗病过程中发挥作用。

OsUPS是一个受磷饥饿诱导的U－box蛋白，在缺无机磷的条件下，水稻植株OsUPS表达水平上调［26］。自身泛素化实验表明，在细菌中表达的Os-UPS具有E3泛素连接酶活性，说明OsUPS可能通过泛素化反应调控磷信号转导途径。

Park等［27］鉴定了水稻细胞质内一个具有E3泛素连接酶活性的U－box蛋白OsPUB15。OsPUB15的T－DNA突变体表现出生长迟缓，幼苗致死，种子不能产生初生根，茎的发育也显著延迟，这些异常的表型能被两种抗氧化剂儿茶素和维生素C部分恢复。与对照相比，突变体中过氧化氢和氧化蛋白的含量更高。在过氧化氢、盐、干旱胁迫下，OsPUB15表达水平明显升高，在高盐条件下OsPUB15超表达植株长势比对照更好。说明PUB15可能通过减少活性氧胁迫正调控水稻逆境胁迫响应过程。

Zeng等［28］利用图位克隆技术分离了一个调控水稻开花期和细胞程序性死亡的基因Spl11，其编码的SPL11蛋白具有E3泛素连接酶活性，该活性依赖于完整的U－box结构域。spl11有一个单碱基替换，导致其编码的SPL11蛋白过早终止，该基因突变后导致水稻开花期延迟和细胞程序死亡加速。VEGA－Sanchez等［29］采用酵母双杂交筛选得到一个SPL11互作蛋白SPIN1，SPIN1是一个RNA/DNA结合蛋白。Spin1超表达转基因植株表现出开花期延迟，是水稻开花期的一个负调控因子。泛素化实验表明SPL11单泛素化SPIN1，这说明SPL11可能通过单泛素化作用抑制SPIN1来促进水稻开花。

4 水稻中SCF型E3介导的生物学过程

在拟南芥中，目前的研究发现很多SCF复合体涉及生长发育等过程中关键步骤的控制，如SCFTIR1介导的生长素反应、SCFEBF1/EBF2介导的乙烯反应、SCFCOI1介导的茉莉酸反应等［6～8］。

而在水稻中，研究比较深入的则只有SCFGID2介导的赤霉素反应。Sasaki［30］等通过对水稻GA不敏感矮化突变体的研究分离出蛋白GID1(GA－insensitive dwarf 1)以及和拟南芥SLY同源的F－box蛋白 GID2(GA－insensitivedwarf 2)。研究发现GID1是GA的信号受体，该蛋白通过GA与SLR1(Slender Rice 1)直接作用。GA诱导SLR1磷酸化，从而促进GID2与磷酸化的SLR1直接相互作用，进而使磷酸化的SLR1被SCFGID2复合体泛素化并通过26S 蛋白酶体降解［31］。

F－box蛋白是一类含有F－box结构域的蛋白家族成员，是SCF复合体的重要组分。其N端有一段含60个氨基酸的F－box保守序列，该F－box结构域负责结合ASK/SKP。F－box蛋白C端部分可以是很多不同类型的蛋白相互作用结构域，负责识别特异性底物和与底物相结合［32］。目前的研究发现，F－box蛋白在水稻生长发育过程起着重要的作用。

OsFbx352是一个表达受ABA诱导的F－box基因，其转录水平会在种子吸涨后增加，而该增加过程明显受到葡萄糖的抑制［33］。OsFbx352超表达转基因植株的种子萌发受葡萄糖的抑制程度比对照要低，而OsFbx352的RNAi转基因植株则比对照要高。在有葡萄糖存在下，过表达OsFbx352植株中ABA合成基因的表达降低，ABA代谢途径相关基因上调。说明OsFbx352对葡萄糖诱导下的抑制种子萌发起到调节作用，而这种调节作用是通过影响ABA代谢实现的。

Duan等［34］发现水稻中的一个 F－box基因DDF1通过调节细胞分裂和细胞伸展影响器官大小。该基因的突变体表现出营养生长和生殖发育异常，除了小穗外所有器官均变小。研究发现DDF1正向调节B类基因OsMADS4和OsMADS16，负向调节雌蕊特化基因DL，这说明DDF1是调控水稻营养生长和花器官特化的一个重要遗传因子。

水稻LP基因编码一个富含Kelch的F－box蛋白［35］。突变体lp表现出花枝梗变多，籽粒数增加。同时突变体较对照更抗倒伏，每株籽粒产量也相应增加。实时定量PCR分析表明，突变体中的Os-CKX2(一个编码细胞分裂素氧化酶/去氧化酶的基因)表达水平出现下调。说明LP可能通过参与调控植物组织的细胞分裂素水平，从而调控水稻株型进而提高水稻籽粒产量。

MAIF1是水稻中一个表达受到ABA和非生物胁迫迅速诱导的F－box基因［36］。过量表达MAIF1降低了水稻对ABA的敏感性和对非生物胁迫的耐受性，促进根的生长。这些结果表明，MAIF1在调节水稻生长过程中参与了多个信号途径。由于限制植株的生长是植物应对非生物胁迫的一种策略，说明MAIF1可能通过控制根系生长在应对非生物胁迫过程中发挥着负向调控作用。

5 研究展望

二十几年前科学家从植物中发现了泛素蛋白酶体降解途径［37］。近年来，科学家在水稻E3泛素连接酶的结构和功能研究方面取得了一定的进展，E3泛素连接酶参与水稻生长发育等方面的调控作用也渐渐清晰。但仍存在很多问题需要解决，例如，水稻中存在着大量的HECT型的E3，它们的功能是什么?水稻中现已发现许多RING型、U－Box型和SCF型E3连接酶，它们的底物蛋白是什么?它们是如何识别底物蛋白的?这些E3是如何被调控的?对这些问题的深入研究，将有助于进一步揭示泛素化途径调控水稻生长发育的机制。

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