奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

郝贵杰，潘晓艺，徐洋，姚嘉赟，尹文林，沈锦玉

(浙江省淡水水产研究所，浙江湖州313001)

奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus是养殖罗非鱼的主要品种之一［1-2］。随着罗非鱼养殖业的发展，罗非鱼病害有逐渐增多的趋势，特别是近年来两广地区及海南省罗非鱼养殖中出现了严重疾病，其病原主要有海豚链球菌Streptococcus iniae和无乳链球菌Streptococcus agalactiae［3-7］。另外，多种水生动物病原性链球菌已被证明可在高等动物或/和人类间传播［8-9］。对罗非鱼链球菌病害的控制目前仍以抗生素为主，长期使用抗生素可诱导耐药菌产生，破坏养殖水体微生态环境，同时抗菌药物残留也是影响水产品质量的重要因素。因此，研制疫苗进行预防显得尤为重要，通过免疫手段有效增强鱼体的主动防御能力，减少疾病发生的机率［10-12］。研究证实，鱼类在受到微生物感染或人工免疫后，均能产生由免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)介导的特异性免疫反应［13］。目前，国内外对罗非鱼的菌苗免疫已进行了大量研究［14-17］，但能够直接反映罗非鱼免疫球蛋白提高从而判断免疫效果的试剂还很缺乏，而针对免疫球蛋白的单抗研究能够弥补这一缺失。有关罗非鱼免疫球蛋白(IgM)的相关研究已有一些报道［18-19］，但有关罗非鱼IgM 单克隆抗体(mAb)研制和应用的研究尚未见报道。为此，本研究中作者开展了罗非鱼IgM mAb 的制备及其初步应用研究，以期为评价罗非鱼链球菌灭活疫苗免疫应答水平及规律提供必要的试剂。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用奥尼罗非鱼体质量为500 ～1 000 g，购自湖州某农贸市场。ICR 小鼠和8 周龄雌性BALB/c 小鼠购自浙江大学医学院实验动物中心。

罗非鱼无乳链球菌L4 由中国水产科学研究院鱼病研究室保存，BHI(脑心浸液培养基)购于杭州天和公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，高糖型DMEM 及HT、HAT 购自Sigma 公司，HRP 羊抗鼠- IgG、邻苯二胺(OPD)均购自华美公司，融合用PEG4000 购自Sigma 公司，其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制备及动物免疫 罗非鱼血清IgM 的制备参照文献［20］，采用饱和硫酸铵沉淀及柱层析方法。用纯化的罗非鱼血清IgM 免疫小鼠的方法及途径参照文献［21 -22］。

1.2.2 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选 按常规方法［20-21］进行细胞融合，阳性杂交瘤细胞株的筛选参照文献［20］中的间接ELISA 方法，不同的是包被抗原用提纯的罗非鱼血清IgM，用免疫小鼠阳性血清做方阵试验决定包被抗原浓度为10 mg/L。

1.2.3 阳性杂交瘤细胞株的建立及腹水的制备将鉴定为阳性的细胞孔中的细胞扩大培养，并及时冻存，同时根据有限稀释法进行亚克隆2 ～3次，至每孔为单细胞克隆及克隆孔阳性率为100%时，即可定株。然后，按照Golding等［23］的方法进行小鼠腹水的制备。

1.2.4 mAb 特性的鉴定

1)mAb 细胞上清及腹水效价。以10 mg/L 纯化的罗非鱼IgM 包被酶标板，于4 ℃下过夜，封闭后分别加细胞上清和腹水抗体，其中细胞上清的稀释梯度为1∶ 200 ～1∶ 12 800，腹水的稀释梯度为1∶ 1 000 ～1∶ 1.024 ×106，每孔加100 μL，其余步骤同文献［20］中的间接ELISA 方法。

2)mAb 灵敏度的测定。用包被液将提纯的罗非鱼IgM 稀释成不同浓度的悬液。IgM 含量从10 mg/L 倍比稀释到2.25 μg/L，分别取100 μL 加至酶标板各孔，一抗为1 000 倍稀释的腹水单抗，其余步骤同文献［20］中的间接ELISA 方法。

1.2.5 Werstern -blot 分析 SDS - PAGE 电泳采用垂直电泳系统，浓缩胶为50 g/L，分离胶为120 g/L。电泳及免疫印迹参考《蛋白质技术手册》［24］中的方法进行。一抗为1∶ 500 稀释的单抗腹水，二抗为1∶ 500的羊抗鼠HRP-IgG。

1.2.6 受免罗非鱼体液的免疫效果评价

1)菌苗的制备及罗非鱼的免疫。罗非鱼无乳链球菌L4 灭活疫苗的制备参照文献［25］中的方法，由中国水产科学研究院鱼病研究室制备。于试验前两周，选取同一批健康的奥尼罗非鱼，体质量为40 ～60 g(购自衢州某奥尼罗非鱼种苗场)。在过滤的池塘水中充氧饲育，水温为20 ～22 ℃。试验共分3 组，每组放45 尾鱼，每组均设3 个重复。3 组分别为腹腔注射免疫组(1 ×108cfu/mL，0.1 mL/尾)、浸泡免疫组(5 ×108cfu/mL，用5 L 浸泡5 min)和磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.2)注射对照组，免疫两周后加强免疫一次，方法同前。于首次免疫后的不同时间进行尾静脉采血，每组分别取3 尾，血液于4 ℃冰箱中过夜，以1 500 r/min 离心10 min 分离血清，每组血清混合后于-20 ℃下保存，用于抗体的检测。

2)建立评价疫苗效果的TAS-ELISA 方法。建立步骤参照文献［26 -27］中的方法，该方法可简化为链球菌包被→不同稀释度的免疫鱼血清→单抗4B3→HRP 酶标抗鼠二抗→显色→终止→读数。

3)受免罗非鱼血清中抗体的测定。每组罗非鱼在免疫后14、21、28、35、42、56、70、84、98 d 分别按照上述方法制备血清，用TAS -ELISA方法进行抗体水平以及最高抗体效价的测定。

2 结果

2.1 蛋白质纯化结果

采用饱和硫酸铵沉淀及柱层析方法制备奥尼罗非鱼IgM，最终收集洗脱峰处的第4 ～8 管蛋白洗脱液，200 μL/管，合并后采用考马斯亮蓝G-250比色法进行蛋白定量。结果表明，纯化的罗非鱼IgM 的质量浓度为4.2 g/L。

2.2 mAb 的筛选及杂交瘤细胞系的建立

采用罗非鱼IgM 免疫小鼠以及细胞融合方法，用间接ELISA 方法检测细胞培养上清，共获得6株抗奥尼罗非鱼IgM 的细胞株，分别命名为1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3，杂交瘤细胞分别经3次亚克隆，100%的细胞孔经检测保持了分泌抗罗非鱼IgM 的能力，经连续细胞传代培养后，各细胞株依然能够稳定分泌针对罗非鱼IgM 的抗体。

2.3 mAb 的生物学特性

6 株mAb 的细胞培养上清及1G11和4B3 腹水的ELISA 效价结果见表1。

表1 6 株mAb 的生物学特性Tab.1 Biological properties of the six monoclonal antibodies

2.4 mAb 敏感性试验

用不同浓度的罗非鱼IgM 抗原包被ELISA 板，用间接ELISA 法测定单抗4B3 的敏感性。结果表明，该腹水单抗间接ELISA 法检测罗非鱼IgM 的灵敏度为10 μg/L。

2.5 Western－blot 结果

采用SDS-PAGE和Western-blot 方法测定单抗4B3 的特异性，结果见图1。

图1 用SDS－PAGE和Western－blot 法对罗非鱼IgM抗原性分析的图谱Fig.1 Identification and specificity of IgM by SDS－PAGE and Western－blot

2.6 免疫奥尼罗非鱼的抗体水平

无乳链球菌L4 灭活疫苗以不同途径免疫罗非鱼后，每组罗非鱼混合血清中抗L4 抗体随时间的变化如图2所示，免疫罗非鱼最高抗体水平的效价如图3所示。

图2 注射及浸泡免疫L4 灭活疫苗后罗非鱼血清的抗体水平Fig.2 The sera antibody levels in the tilapia injected by and bathed in inactive vaccine L4

图3 注射及浸泡免疫L4 灭活疫苗后罗非鱼最高抗体水平时的效价(免疫35 d)Fig.3 The peak titer of the antibody in the tilapia injected by and bathed in inactive vaccine L4(35 days after immunization)

3 分析与讨论

罗非鱼养殖过程中发生的链球菌病害，严重影响了该产业的发展。而抗生素治疗具有较多的负面作用，疫苗的研制及开发已成为控制该病的一个重要手段。Pasnik等［14］研究了无乳链球菌特异性抗体对尼罗罗非鱼的被动免疫作用，证实无乳链球菌的特异性抗体在罗非鱼对无乳链球菌的免疫中发挥主要作用。Shoemaker等［15］研究了利用OraljectTM技术运送海豚链球菌冻干口服疫苗免疫罗非鱼的效果，结果表明该疫苗对链球菌病可提供保护，但较腹腔注射疫苗组效果差些。目前，鱼类疫苗的免疫效果多采用传统的免疫保护力和血清抗体凝集效价进行评估，因为不同鱼的免疫球蛋白差异较大，目前也没有商品化的二抗产品，所以研究罗非鱼链球菌疫苗免疫效果，阐明罗非鱼受免后保护性抗体产生的规律及水平，制备针对其免疫球蛋白的单抗成为关键。本试验中制备了这一必要的试剂，并做了初步应用。

关于鱼类的免疫球蛋白，近年来已开展了较多的研究，一般认为硬骨鱼类的免疫球蛋白为IgM，通常鱼类的免疫球蛋白是由4 个Ig 分子组成的四聚体，每个Ig 分子由2 个重链(H 链)和2 个轻链(L 链)组成，H 链相对分子质量一般为60 000 ～81 000，L 链相对分子质量一般为20 000 ～30 000［28-30］。不同鱼类的IgM 分子存在一定差异，本研究中采用饱和硫酸铵粗提和凝胶分子筛层析方法提纯罗非鱼免疫球蛋白，经SDS -PAGE 电泳分析表明，纯化的Ig 的H 链、L 链分子量大小与报道类似。取适当纯化的IgM 免疫小鼠，通过细胞融合以及多次的克隆和筛选，共获得了稳定分泌抗罗非鱼IgM mAb 的杂交瘤细胞6 株:1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3。Western -blot 试验结果表明，mAb 4B3是针对罗非鱼Ig 分子重链的。这与作者之前制备的草鱼免疫球蛋白单抗针对其重链的结果相似［20］，这是因为鱼的血清Ig 分子与脊椎动物的IgM 分子相似，重链的恒定区氨基酸序列多，结构复杂，可提供多个抗原结合表位;而轻链就相对简单，其上免疫表位少，所以强阳性的单抗细胞株绝大多数是抗IgM 重链的，在单抗筛选过程中针对轻链的杂交瘤细胞很容易丢失和放弃。已报道的抗鱼类Ig 的单抗也是多数只可以识别鱼的Ig重链，仅有少量针对轻链［31］。用不同浓度的罗非鱼IgM 抗原包被ELISA 板，用间接ELISA 法测定4B3 的敏感性，结果表明，该单抗间接ELISA 法检测罗非鱼IgM 的灵敏度为10 μg/L，这种高灵敏性的mAb 为罗非鱼传染性疾病的免疫学研究和血清学调查提供了可靠的试剂。

本研究中利用所制备的单抗，建立了以单抗4B3 为核心的三抗体ELISA 方法(TAS -ELISA)，并用该方法评价了在实验室开展的无乳链球菌L4灭活疫苗免疫罗非鱼的免疫效果，实验室免疫罗非鱼选择腹腔注射和浸泡免疫方式。结果表明，罗非鱼免疫14 d 后，受免鱼血清抗L4 的抗体比对照组稍有增加，进行加强免疫后，也就是在首次免疫21 d 后，两种免疫方式的鱼血清抗L4 的抗体均有明显增加，免疫35 d 后增加更为显著，达到最高峰，但免疫56 d 后抗体开始下降，直到第98天还维持在明显高于对照组的抗体水平。罗非鱼免疫35 d 时，注射免疫产生的抗体效价达1∶ 2 560，浸泡免疫产生的抗体效价达1∶ 640，可见罗非鱼注射免疫效果要优于浸泡免疫，但浸泡免疫具有操作方便、对鱼体损伤小的优势，这些结果为罗非鱼无乳链球菌灭活疫苗的中试及示范奠定了基础。

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