缺血再灌注对大鼠睾丸脑红蛋白表达的影响

徐国辉，杨文涛，马书玲，秦豪杰

精索静脉曲张和睾丸扭转等是影响男性生殖健康、导致男性不育的常见原因，临床上不管是进行积极的外科治疗还是保守治疗，总有一部分病例发生睾丸萎缩、血清睾酮水平下降、精子功能低下等不良后果[1-3]。究其原因，除缺血缺氧性损伤外，恢复血供后组织中产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的损害作用也是一不可忽视的因素[4，5]。脑红蛋白(neuroglobin, NGB)是主要在脊椎动物神经细胞内表达的携氧球蛋白，有对抗组织细胞缺氧和清除氧自由基的作用[6，7]。前期研究发现，NGB在成年男性生殖系统特别是睾丸组织内有广泛分布[8]，认为其可能对细胞内环境稳态的维持及生殖内分泌功能的发挥有一定的积极意义。为了探讨NGB在睾丸缺血再灌注损伤后的表达变化及意义，本实验运用实时荧光定量PCR和Western blot技术对NGB在大鼠睾丸组织缺血再灌注后的表达变化水平进行检测。

1 材料和方法

1.1动物模型及取材健康雄性SD大鼠48只(体质量200～250 g)，购自河南科技大学实验动物室。随机分为实验组(分6个时间组)、假手术组和正常对照组，每小组6只。实验组大鼠腹腔麻醉(2%戊巴比妥钠，50 mg/kg)后取左下腹切口，暴露左侧睾丸动脉，血管夹夹闭15 min后去除血管夹并缝合切口，假手术组采用相同操作但不夹闭睾丸动脉。分别于再灌注后3、6、12、24、48、96 h断颈处死大鼠，提取睾丸并沿横轴切开，1份甲醛固定用于组织切片制作，1份用于总RNA及总蛋白提取。

1.2组织切片制作及观察组织标本经10%中性甲醛溶液固定，常规取材、脱水、石蜡包埋、切片后行HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察并照相。

1.3mRNA表达水平的检测

1.3.1睾丸总RNA提取 按RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa公司)说明书进行。NanoDrop 1000测定RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA提取质量。-80℃保存备用。

1.3.2引物设计与合成 引物由TaKaRa公司设计合成。NGB引物序列为：5′-GGGCTCCTCCTGTCACCTTAC-3′(forward)，5′-TCCCACTCTATTTGCTCTCGC-3′(reverse)，扩增片段长度157 bp。内参18S rRNA引物序列为：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′(forward)，5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′(reverse)，扩增片段长度151 bp。

1.3.3RNA逆转录及常规PCR检测目的基因扩增片段 应用逆转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas公司)对RNA进行反转录，cDNA产物-20℃保存备用。将cDNA进行常规PCR扩增(PCR Master Mix，Fermentas公司)，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳验证其特异性并送生物公司测序正确后进行下述操作。

1.3.4实时荧光定量PCR检测(双标准曲线法) 将正常对照组的PCR产物分别经核酸纯化试剂盒(DNA Fragment Purification Kit，TaKaRa公司)纯化后，按101、102、103、104、105、106倍进行倍比稀释，用于标准曲线的制作。按定量PCR试剂盒(Maxima®SYBR Green qPCR Master Mix，Fermentas公司)说明书配制反应体系，25 μL体系内含：2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、ROX Solution 0.05 μL、Template DNA 1 μL。每个样品设置三管复孔。PCR参数：95℃ 10 min预变性；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。结果由荧光定量分析仪(Applied Biosystems 7500)自动采集。扩增反应结束后，进行融解曲线分析，判断产物的特异性。

1.4蛋白表达水平的检测RIPA裂解法提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度并调整一致，取等量样品加上样buffer后煮沸10 min变性，各取10 μl行SDS-PAGE电泳，转膜(PVDF膜)后按分子量大小剪开，分别小鼠抗人NGB单克隆抗体(1∶500，Abcam)、小鼠抗人beta aictin单克隆抗体(1∶1000，中杉金桥)4℃孵育过夜，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室温孵育1 h，加入UltraECL底物化学发光检测试剂(百泰克)，凝胶成像系统(Bio-Rad)检测拍照，条带光密度值运用Image-Pro Plus 5.1软件进行分析。

2 结果

2.1形态学变化HE染色结果显示正常对照组和假手术组睾丸组织细胞形态良好，两者未见明显差别。缺血再灌注后，睾丸生精细胞水肿，细胞周隙明显增宽，至96 h后可见生精细胞层数减少，排列紊乱，管腔内精子细胞减少。

2.2NGBmRNA表达变化NGB及18S融解曲线均为单峰，无引物二聚体及非特异扩增产物。二者标准曲线斜率分别为-3.442和-3.607，相关系数分别为0.997和0.996。根据扩增效率计算公式E=10[-1/slope]-1(E为扩增效率，slope为斜率)，得到的扩增效率E分别为0.952和0.893，在理想范围(0.8

2.3NGB蛋白表达变化Western blot检测分析发现，缺血再灌注后NGB表达逐渐升高，于12 h达高峰，其中6、12和96 h组与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

精索静脉曲张和睾丸扭转对睾丸损害的实质是缺血缺氧性损伤，然而外科手术或复位后的血液再灌注对局部组织细胞亦有一定的损伤作用，这可能是导致部分患者不育的原因之一[1-5]。因此睾丸缺血再灌注损伤机制及防护措施的研究一直备受关注。本实验采用睾丸动脉夹闭法制作睾丸缺血再灌注损伤模型，可以更准确地控制睾丸缺血程度，减少实验对象之间的差异。而且，此方法较精索静脉曲张模型和睾丸扭转模型操作简便，可重复性更强，对单纯的睾丸缺血再灌注损伤病理改变及机制方面研究来说，不失为一种简单有效的方法。

目前对NGB的研究主要集中在缺血缺氧性脑损伤及相关疾病方面，认为它可能通过携氧、贮氧和氧感受器功能，NADH氧化酶作用，以及ROS和NO基团清道夫等功能，对脑缺血缺氧性损伤起到保护作用[6，7，9，10]。

正常情况下机体氧自由基的产生、利用和清除之间处于一种动态平衡。但在睾丸缺血/再灌注时，ROS产生过多，使睾丸处于氧化应激状态，组织细胞损伤，生精细胞凋亡增加[11，12]。因此，及时清除过多ROS的损害作用，提高睾丸组织的缺血缺氧耐受能力，将会减轻上述疾病和损伤的睾丸损害作用，从而改善预后，减少男性不育的发生。本实验显示NGB于睾丸缺血再灌注后表达升高，特别是6～12 h升高最为显著，鉴于NGB的前述功能作用，NGB可能在睾丸抗缺血再灌注损伤方面有一定的积极意义，并有可能作为精索静脉曲张和睾丸扭转等疾病的康复辅助治疗的新靶点。不过，其具体效果及机制仍需要进一步的实验证实。

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