人脑胶质瘤标本库的初步建立与管理

焦保华，梁朝辉，王苑宇，孙实安，席增辉

（河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄050000）

人脑胶质瘤标本库的初步建立与管理

焦保华，梁朝辉，王苑宇，孙实安，席增辉

（河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄050000）

目的建立脑胶质瘤标本库，充分保护和合理应用胶质瘤标本，为胶质瘤的临床及科研提供肿瘤标本。方法收集脑胶质瘤患者手术前静脉血、获取新鲜肿瘤组织标本和部分正常脑组织标本，分别提取血液及组织标本中DNA、RNA以及蛋白，贮存于－196℃液氮罐中，记录每例患者流行病学特点及病理诊断，术后6个月开始进行随访。结果全血及组织中提取的基因组DNA、组织标本中提取的总RNA其OD260/280比值都在1.8～2.1之间、所提取蛋白经二辛可酸法蛋白定量检测均能够满足胶质瘤分子生物学研究的需要。结论脑胶质瘤标本库的初步建立，形成了一套系统的、可行的胶质瘤标本库的建设及管理方法，可为胶质瘤的分子生物学研究提供标本和相关资料来源。

神经胶质瘤；生物标本库；组织和管理

脑胶质瘤是严重危及人类生命的恶性肿瘤之一，其发病率占颅内原发肿瘤的44.7％［1］。彻底认识胶质瘤分子生物学特性、有效的治疗胶质瘤、防止胶质瘤的复发是当今胶质瘤研究领域中亟待解决的难题。收集足够数量的胶质瘤标本是成功开展胶质瘤实验研究工作的基本条件之一，建立胶质瘤标本库已引起全世界神经胶质瘤研究治疗中心的广泛重视。

1 资料与方法

1.1 主要设备：TAYLOR-WHARTON低温罐（美国），樱花全自动组织包埋机（日本），RM2135型切片机（德国LEICA公司），CS-VI型摊片烤片机（孝感宏业医用仪器有限公司），离心机LXJ-64-01（北京），eppendorf核酸蛋白定量测定仪（德国eppendorf公司），全自动酶标分析仪（美国，Invitrogen公司）。

1.2 主要试剂：Trizol（美国Invitrogen公司），蛋白酶K（德国），亚硫酸氢盐（美国Sigma），对苯二酚（美国Sigma），Wizard DNA纯化试剂盒（美国，promega），蛋白裂解液RIPA、PMSF（北京博奥森公司），二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（武汉博士德）。

1.3 血液标本的收集、处理及保存：选择拟进行手术切除治疗的脑胶质瘤患者，签署知情同意书，抽取静脉血10mL，其中5mL应用Wizard DNA纯化试剂盒提取血液基因组DNA，放入－4℃冰箱冻存备用。另5mL血液静置2～3h后，使用3000r/min离心机离心10min，吸取血清后分装到标记好的冻存管内进行液氮冻存。

1.4 胶质瘤标本的收集、处理及保存：选择拟进行手术切除治疗的胶质瘤患者，签署知情同意书，标本在手术过程中获取，正常脑组织来自于大脑半球非功能区的瘤周正常脑组织，肿瘤组织与正常脑组织的辨认至少由2名神经病理科医师进行诊断，在保证医院病理科留取有足够用于诊断的标本后，分别将所获组织切成数块，一部分标本放入已贴好患者信息的无菌冻存管中，立即投入便携式液氮瓶中，之后转存入实验室液氮罐中进行保存，用于组织RNA、DNA、总蛋白的提取；另一部分标本放入10％甲醛固定，择期石蜡包埋进行免疫组织化学检测。

1.5 标本RNA、DNA及蛋白的提取：对血液和组织基因组DNA的提取按照试剂操作说明书的流程进行操作，按照组织RNA、DNA及蛋白提取裂解流程，提取组织RNA、DNA及总蛋白。

1.6 术后患者随访：对纳入标本库的患者，在手术后6个月开始进行随访调查。调查内容包括术后的放疗和化疗情况，以及患者的生存期。目前随访正在进行中。

1.7 数据库的建立与管理：自行设计开发出一套信息管理系统应用于标本库的管理，由专人负责标本收集、保存及其使用。信息管理系统主要内容如下。①患者信息录入，包括患者的姓名、性别、年龄、职业、住院号、病理号、临床诊断、病理诊断、病程和病期、随访联系方式等。②标本存放位置信息，包括入库日期、编号、标本数量、存放位置坐标等。③标本使用管理，包括使用人、出库日期、标本原始位置、审批人、经手人等。④留取患者影像学资料。

2 结 果

2.1 标本收集情况：完成了标本库信息数据管理软件的开发工作，并将该信息管理软件系统应用于肿瘤标本库的管理，对所收集患者的临床特征、标本数量、标本存放位置等信息按上述数据库的管理要求录入计算机归档管理。截至2011年10月1日共收集新鲜脑胶质瘤标本113例，正常对照脑组织31例。已经提取获得不同级别脑胶质瘤全血DNA 67例，制作组织蜡块93例，提取组织DNA及RNA 79例及肿瘤总蛋白质73例。

2.2 肿瘤标本的初步应用：①通过免疫组织化学方法检测到增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-Methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）、CD133、巢蛋白Nestin、增殖细胞相关的核抗原Ki-67、Notch2、基质蛋白金属酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1（thewild-type P53-induced phosphatase 1，Wip1）在83例脑胶质瘤组织中的表达情况，进行生存分析，已经得到初步数据。②从胶质瘤标本中所提取的RNA经核酸定量仪检测，具有较高纯度（OD260/280比值1.8～2.1），琼脂糖凝胶电泳有清晰的28s，18s及5s，说明提取的RNA完整。③脑胶质瘤患者全血标本和肿瘤组织中提取的基因组DNA，经核酸定量仪检测，其OD260/280比值为1.85～2.00，适合进行肿瘤的基因组学研究。④以牛血清白蛋白作为标准品，BCA法蛋白定量检测试剂盒测定蛋白质浓度与标准曲线拟合良好。⑤应用半定量－聚合酶连反应和Westernblot的方法对胶质瘤中某些基因表达进行了基因和蛋白水平的检测，得出Notch2、MMP-9、Wip1等指标在脑胶质瘤组织中存在mRNA和蛋白水平高表达。

3 讨 论

随着科学技术的不断提高，实验条件的不断完善，创建标准肿瘤标本库已经受到一些发达国家的政府和研究机构的重视［2］。目前，国内许多肿瘤研究单位都建立或开始着手筹建自己的肿瘤资源库［3－5］。随着社会保障体系完善提高及医疗技术的革新，脑胶质瘤发病率呈逐年增高的趋势，脑胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性的颅内恶性肿瘤之一，手术、放化疗等综合治疗并未能防止肿瘤浸润性生长及复发，最终危及患者生命。要实现有效的治疗及防止胶质瘤术后的复发，必须对胶质瘤分子生物学特性进行深入研究。

手术切除的胶质瘤标本是胶质瘤基础与临床研究的必备材料，是不可再生资源。提供确诊的、合乎科研设计要求的胶质瘤标本和胶质瘤患者的血清标本以及正常对照标本，有利于充分有效利用胶质瘤资源，为胶质瘤的基础和临床研究工作提供平台。我们应用目前库存胶质瘤标本，通过检测胶质瘤标本组织中MGMT甲基化情况，对于指导胶质瘤患者的化疗起到了重要意义［6］。另外，我们研究得出Wip1在高级别胶质瘤组织中存在高表达，并与患者预后差相关［7］。

目前，我科对脑胶质瘤的标本库建立与管理已经取得了初步经验，取材技术路线已经基本成熟和规范。为了获取合格的、能够满足科学研究的需要，在胶质瘤的整个取材过程中我们已经得到初步经验。首先，在对胶质瘤组织选取上，应该避免坏死肿瘤组织区域，避免对标本反复电凝烧灼，离体组织标本应该用冰盐水清洗后尽快放入固定液中进行保存，以避免标本组织中的DNA、RNA和蛋白的降解；取材过程中应该遵循无菌原则，避免外源性污染，操作过程需戴手套，所使用的器械、吸头和冻存管等使用前须经高压消毒处理。另外，保存标本时，应分装成多管，以便标本以管为单位出库，避免反复冻融，标本一旦出库即不能再入库。

ESTABLISHMENT AND MANAGEM ENT OF GLIOMAS TISSUES BANK

JIAO Baohua，LIANG Chaohui，WANG Yuanyu，SUN Shian，XIZenghui
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang，050000，China）

glioma；biological specimen banks；organization and administration

R739.41

A

1007-3205（2013）04-0388-03

2012－06－12；

2012－09－17

焦保华（1954－），男，河北辛集人，河北医科大学第二医院主任医师，教授，医学博士，从事神经外疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.006

【关键词】ABSTRACT：ObjectiveTo protect and utilize the tumour tissue resources fully and provide a suitable number of glioma tissues for studying the disease，the glioma bank was established.M ethodsThe tumour tissueswere collected during operation，including tumour，adjacent non-cancerous tissue and the serum of patientswere obtained before operation.RNA，DNA and protein of the tissueswere collected and stored with liquid nitrogen.A set of detailed information of the patients was recorded.ResultsGenomic DNA and RNA were extracted from the whole blood and tumor tissue of glioma patients，whose OD260/280 ratioswere between 1.8－2.1.The protein was extracted from glioma tissues，which could meet the need ofmolecular biology research by the bicinchoninic acid（BCA）protein assay detection.Conclusion A certain size of glioma tissue bank and a set of related methods have been established and formed for supplying a service platform of glioma research in the future.