固相萃取在喹诺酮类兽药残留液质检测中的应用

马建民 艾君涛 曹 靖 （北京农业职业学院 北京 房山 102442)

兽药痕量残留分析中，样品的前处理极为重要，也是其难点所在。由于动物组织多样性和复杂性，目前还没有一种前处理技术能够适合所有情况下的所有样品。本文对近年来发展起来的固相萃取、碳纳米管固相萃取、限进介质固相萃取、免疫亲和固相萃取、分子印迹固相萃取、基质固相分散萃取、分散固相萃取等在喹诺酮类兽药残留液质(LC-MS)检测分析中的应用进行了综述，对未来的发展前景作了展望。

喹诺酮类(Quinolones，QNs)是人类继磺胺类药物之后在抗菌药物合成方面最重要的突破，因其具有高效，低毒，组织穿透力强及价格低廉等特点，被广泛应用于动物养殖中。但随着该类药物的大量和非科学地使用，造成其在动物体内残留，并通过食物链进入人体，从而影响人体健康。因此，动物体内的QNs残留检测备受关注。由于动物组织基质复杂，提取净化方法的优劣成为测定结果准确与否的关键。固相萃取(SPE)作为一项前处理技术，在食品安全检测中得到广泛应用。

1 固相萃取

SPE是一种基于色谱分离的样品前处理方法。固相萃取包括固相(具有一定官能团的固体吸附剂)和液相(样品及溶剂)。装有固体吸附剂的固相萃取装置包括：固相萃取柱、固相萃取膜、固相萃取吸嘴、固相萃取芯片等。由于固体吸附剂具有不同的官能团，能将特定的化合物吸附并保留在SPE柱上。

1.1 常见固相萃取材料

常见固相萃取材料主要包括：键合硅胶材料、无机基质固相萃取材料、有机聚合物固相萃取材料及混合型固相萃取材料。

1.1.1 键合硅胶吸附剂的基质是硅胶 一般在pH2～7的范围内较为稳定。不同厂家生产的C18柱，由于颗粒大小不同，孔径大小不同，含碳量不同，封尾的程度不同等原因，在相同的操作条件下得到的结果可能会有很大不同。

1.1.2 无机基质固相萃取材料 主要是无机氧化物和石墨碳类无机物。无机氧化物有活性硅土、氧化铝、弗罗里硅土等。这些无机材料的共同特点是表面具有活性羟基，可以用于正相萃取。石墨碳类，即可保留非极性化合物又可保留极性化合物，而且特别适合用于水溶性的极性化合物的萃取。

1.1.3 聚苯乙烯-二乙烯基苯 (PS-DVB)具有疏水表面，属于有机聚合物非极性的固相萃取材料。吸附能力比C18更强。含有不同极性官能团的化学改性聚合树脂材料具有很好亲水性，在萃取水中的极性化合物能够得到较高的回收率。二乙烯基苯-N-吡咯烷酮聚合物(DVB-VP)具有亲脂性基团二乙烯基苯和亲水性基团吡咯烷酮，比反相键合硅胶吸附剂的应用更广泛。且DVB-VP的亲水官能团，使得吸附剂得到充分润湿，即便柱床干了也没有明显影响。

1.1.4 混合型固相萃取材料 混合型SPE柱具有多种类型的官能团，可以和目标化合物发生多种作用力，从复杂的样品基质中萃取分离目标化合物。例如，Waters公司生产的Oasis MCX和Oasis MAX。赵维国[1]在《食品中抗生素和农药残留分析：用于LC-MS分析的SPE样品前处理方法》中，详细介绍了Oasis MCX 和Oasis MAX选择和使用方法。

1.2 新型固相萃取材料

1.2.1 碳纳米管固相萃取 碳纳米管(CNTs)是由单层或多层石墨片围绕中心轴按一定的螺旋角卷绕而成的无缝、中空的“微管”，每层由一个碳原子通过sp2杂化与周围3个碳原子完全键合后所构成的六边形组成的圆柱面。根据形成条件的不同，碳纳米管存在多壁碳纳米管(MWNTs)和单壁碳纳米管(SWNTs)两种形式。MWNTs一般由几层到几十层石墨片同轴卷绕构成，层间间距为0.34nm左右，其典型的直径和长度分别为2～30nm和0.1～50nm。SWNTs由单层石墨片同轴卷绕构成，其侧面由碳原子六边形排列组成，两端由碳原子的五边形封顶。管径一般10～20nm，长度一般可达数十微米，甚至有长达20cm的SWNTs。与MWNTs相比，SWNTs具有直径分布范围小，缺陷少，更高的均匀一致性等特点。SWNTs存在3种类型的可能结构，分别为单臂碳纳米管、锯齿形碳纳米管和手性碳纳米管[2]。

CNTs与化合物之间存在π-π共轭等相互作用力和较强的表面吸附作用，作为固相萃取吸附剂可用于多种残留物的净化分析。赵海香[2]使用多壁碳纳米管(WMCNTs)固相萃取柱对鸡肉和猪肉中的3种四环素类和两种喹诺酮类药物净化并进行了液质检测。其中，喹诺酮类的检出限为5μg/L，减少了基质效应。

1.2.2 限进介质固相萃取 限进介质固相萃取材料(RAM)除了具有用于吸附目标化合物的官能团外，在固相萃取材料的外表面进行亲水性修饰，具有阻挡干扰大分子的作用，同时又使得大分子蛋白质不会发生不可逆的变性，避免了因变性蛋白质堵塞SPE填料微孔而造成柱效降低的问题。RAM材料具有以下几个特征：具有特定的排阻屏障；具有生物兼容的外表层；具有吸附功能的内表层。Varian公司的Bond Elut Plexa系列的聚合树脂柱是商品化的RAM柱。

包晓丽[4]使用Bond Elut Plexa固相萃取柱检测了牛奶中22中QNs类药物。结果表明：定量限(LOQ)为0.008～0.339μg/kg。除了氟甲喹、萘啶酸、那氟沙星的回收率小于60%外，其它喹诺酮的回收率均在63.1%～94.6%之间，相对标准偏差为0.86%～13.12%。

1.2.3 免疫亲和固相萃取 免疫亲和固相萃取(IASPE)是将免疫亲和技术与固相萃取技术交叉地结合在一起，用于样品的分离净化。基于分子识别机理的IASPE，以高亲和性及高选择性的抗原-抗体作用使得人们可以一步萃取及浓缩特定的目标化合物。

赵思俊[5]用喹诺酮单克隆抗体制备的IASPE，建立可同时测定动物肝脏组织中10种NQs的方法。IASPE的净化方法为：用15ml磷酸盐缓冲液（PBS）平衡；取肝脏样品提取上清液上样；PBS、水洗涤IASPE；甲醇-PBS(7:3)洗脱、收集、氮气吹干、PBS定容、待检；IASPE加15～20ml PBS溶液再生，4℃冰箱保存。

1.2.4 分子印迹固相萃取 分子印迹固相萃取(MISPE)是以分子印迹聚合物(MIP)为吸附剂的固相萃取。分子印迹固相萃取吸附剂是一种稳定性很高的聚合物。MIP是通过两个以上的不同种类的单体聚合而成的共聚物。首先是将经过细心选择的官能团单体与模板组合在一起，然后，在交联剂存在下，这些单体与聚合材料进行聚合反应。最后，将模板除去，得到具有选择性官能团的三维立体结构的MISPE吸附剂。最直接的模板分子就是选用待测目标化合物。MIPSPE柱能够选择性地从复杂的样品基质中萃取相关的目标化合物。

朱桂芬[6]制备了加替沙星分子印迹聚合物(MIP)微球，并对其性质进行了深入研究。夏环[7]以诺氟沙星为模板分子，合成了对氟喹诺酮类特异性识别的MIP，其印迹因子为3.17，亲和位点总数为3.37μmol/g.。该MISPE可吸附溶解在乙腈中的诺氟沙星、环丙沙星和沙拉沙星，而被不同比例水乙腈洗脱。刘芃岩[8]以左氧氟沙星和环丙沙星为模板分子，合成了复合模板分子印迹聚合物，制成了MISPE柱，用于草鱼中10种NQs的萃取，富集净化。与单模板分子印迹聚合物只选择吸附单一物质相比，可同时吸附和解吸一类物质，更适合于多残留药物的同时分离富集。

2 基质固相分散萃取

基质固相分散(MSPD)是将样品与固体吸附剂一起研磨之后，使样品成为微小的碎片分散在固相吸附剂表面。然后将此混合物装入空的SPE柱或注射针筒中，用适当的溶剂将目标化合物洗脱下来。

MSPD萃取技术的主要优点有：适用于固体、半固体及粘稠样品的萃取；萃取溶剂与目标化合物的接触面积增大，有利于目标化合物的萃取；容积完全渗入样品基质中，提高了萃取效率。但是该技术不易实现自动化，手工操作工作量大。

3 分散固相萃取

分散固相萃取(d-SPE)是将固相萃取吸附剂颗粒分散在样品的提取液中，除去样品中的杂质干扰物。d-SPE最典型的应用是在多农药残留检测中使用的QuEChERS样品前处理方法。基于d-SPE的基本原理，博纳-艾杰尔科技公司提出了MAS(multi-adsorption reverse SPE)样品萃取净化方法。将粉碎的样品置于离心管中，加入提取溶剂，试剂(如无水硫酸钠、无水硫酸镁等除水剂)及填料，均质或超声波萃取，离心后取上清液进行仪器分析。MAS方法具有快速、萃取和净化一步完成的特点，但是难以实现对痕量物质的富集，净化效果有时不理想，对某些杂质无法除去。

曹军[9]用分散固相萃取同时检测了19种喹诺酮类药物。前处理方法：样品加入无水乙酸钠，无水硫酸镁；1%冰乙酸(用正己烷饱和)乙睛溶液提取；旋蒸；氮吹干；甲醇-水(2:8)定容，然后加适量PSA吸附剂、C18吸附剂，上清液过滤膜，进行测定。不同基质应调整吸附剂的用量，避免其对药物产生吸附。李锋格[10]用分散固相萃取建立了鸡肝中12种磺胺类、19种喹诺酮类和8种苯并咪唑类药物及其代谢物残留的分析方法。文章中指出，存在基质干扰，需要使用基质标准曲线和同位素内标定量。

4 小结

随着LC-MS的普及，开发LC-MS方法成为趋势。但是检测生物样品时，LC-MS常出现基质干扰现象[11]。解决基质干扰的方法之一就是改进样品的前处理。相对传统前处理方法，固相萃取技术显然是目前最可能满足这一要求的方法。

固相萃取技术处理样品，有两种模式，一种是吸附目标化合物，一种是吸附杂质。从吸附目标化合物方面考虑，应提高吸附剂与目标化合物作用力，如MIP固相萃取材料。这种选择性强的吸附剂，不利于建立多残留的检测方法。从吸附杂质角度考虑，明确各种组织的主要干扰物，使用净化不同杂质的吸附材料包，并确保其对目标化合物的不吸附。两种方法可以结合使用。

可见，使用固相萃取技术，降低基质干扰，需使用选择性强的吸附剂；要增加检测的数量和种类，需使用选择性差的吸附剂，或者使用吸附杂质的吸附剂。可以展望在未来的一段时间里内，将现有的SPE技术更广泛的应用于食品检测，将是科研工作者的主要工作。

[1]赵维国, 安蓉, 霍润兰.食品中抗生素和农药残留分析：用于LCMS分析的SPE样品前处理方法[J].现代科学仪器, 2005, 1(99):10～14.

[2]蔡称心, 陈静, 包建春等.碳纳米管在分析化学中的应用[J].分析化学.2004, 3（32）：381～ 387.

[3]赵海香, 孙艳红, 丁明玉等.多壁碳纳米管净化/超高效液相色谱串联质谱同时测定动物组织中四环素与喹诺酮多残留[J].分析测试学报, 2011, 6(30): 635-639.

[4]包晓丽, 任一平, 张虹.超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法检测牛奶中22种喹诺酮类抗菌素[J].分析化学, 2009, 3(37): 389-394.

[5]赵思俊, 郑增忍, 曲志娜等.免疫亲和色谱-HPLC-FLD法测定动物肝脏中10种喹诺酮类药物残留[J].分析化学, 2009, 3(37): 335-340.

[6]朱桂芬, 高燕哺, 高霞等.加替沙星印迹聚合物微球的合成及特异吸附性能[J].化学学报, 2011, 8(69): 973-980.

[7]夏环, 王妍, 荆涛等.分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中三种氟喹诺酮类抗生素残留[J].分析科学学报, 2012, 2(28): 297-302.

[8]刘芃岩, 申杰, 刘磊.复合模板印迹聚合物净化液相色谱-质谱联用法测定鱼肉中氟喹诺酮类残留[J].分析化学, 2012,5(40) :693-698.

[9]曹军, 陈勇, 杨瑞章等.分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中19种喹诺酮类兽药残留[J].中国兽药杂志, 2011, 45(7):21-25.

[10]李锋格, 苏敏, 李晓岩等.分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肝中磺胺类、喹诺酮类和苯并咪唑类药物及其代谢物的残留量[J].色谱, 2011, 2(29): 120-125.

[11]贾彦波, 王清清, 宋海峰.高效液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS)分析生物样品时的基质效应研究[J].军事医学, 2011, 2(35): 149-152.