禽流感的实验室诊断技术

荆玉伟 （山东省诸城外贸绿安检测有限公司 262200）

禽流感是一种急性传染病，每次爆发不但给养禽业造成巨大经济损失，而且严重威胁人类的健康。由A型流感病毒引起的禽流感，其临床症状因感染禽的种类、年龄、病发感染情况及新感染毒株的毒力不同而表现不一致，其病理变化因感染病毒株毒力的高低、病程长短及种类不同表现也不尽相同，而且无一为特征性症状和剖检变化。因此，快速、特异的诊断技术对于禽流感的预防显得非常重要。近年来，随着血清学实验技术和生物工程技术的飞速发展，禽流感诊断技术的研究也不断深入相继建立了病毒分离鉴定、血清学实验检测、分子生物学等诊断技术。本文就这些方法的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述，以期为控制禽流感的疫情赢得时间。

1 病毒的分离鉴定

由于禽流感的临床症状和剖检变化较大且无特征性病变，所以多年来禽流感的确诊一直依赖于病毒的分离和鉴定，禽流感病毒分离和鉴定的方法在工作中不断被完善。一般用无菌的棉拭子从活禽的气管和泄殖腔采取深部病料放入无菌培养液，或无菌采取病变组织磨碎制成10%悬液，然后接种于9～11日龄SPF鸡胚，收获24～96h的死胚和96h仍存活的鸡胚尿囊液，测其血凝活性，若血凝活性为阴性，应将收获的鸡胚尿囊液原倍继续盲传2～3代。对具血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清作HI试验，以排除新城疫病毒的可能性。对新城疫病毒血清的HI阴性者再用琼脂糖免疫扩散试验(AGID)来检测特A型禽流感病毒的型特异性。最后用禽流感病毒分型血清作血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验(NI)以鉴定A型流感病毒的亚型。在病毒分离和鉴定的同时，一般还需做病毒的致病性试验，以确定所分离的毒株是高致病力株还是低致病力株或是非致病力株。病毒的分离鉴定对禽流感的诊断可做最终确诊，但其操作程序复杂，花费高，耗时耗力。

2 血清学检测

2.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 HI试验是进行全球流感监测所采用的普及方法。当检测出具有血凝素活性的样品后，需要用已知阳性血清进行试验来验证，并据此确定其亚型，也可用试验来测定和定量感染后或注射疫苗后的特异性血清抗体。试验是通过特异性抗体与相应亚型的作用后，封闭了其血凝素的活性而抑制了现象。此外，还有加酶法，即将抗原和抗体在37℃或室温下作用下，加入鸡红细胞，该法检测的抗体效价比常规方法高2～4倍。试验简便快速、特异性好，是亚型鉴定的常用方法。由于用已知亚型的抗血清不能检出新的亚型，所以用该法鉴定不如琼脂扩散凝胶试验简便快捷。

2.2 琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID) 免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。AGID是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体即抗核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的抗体的一项试验，AGID最常用的方法是免疫双扩散(IDD)。另外，还有免疫单辐射扩散试验(SRD)和对流免疫电泳(CIE)。其中SRD可对抗体进行定性或定量检测。而CIE相对而言则较为敏感，操作简单，所需时间最短，1h即可出结果。李海燕等(2000)用O.5g/ml的NP-40处理病毒蛋白作为AGID试验用抗原，能检出禽流感各型阳性血清，而与ND、MD、IB等15种其他鸡的疫病阳性血清均无交叉反应。邓国华等人用禽流感病毒核蛋白作为抗原进行AGID试验，并取得了良好效果。赵增连等(1997)在琼脂板中加入3%的PEG-6000，则AGID的敏感性提高，且更加快速省时。

2.3 神经氨酸酶抑制试验(NIT) 根据A型流感病毒的表面抗原特性，特别是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)特性，不仅可通过HI试验对病毒进行鉴定，而且可通过NI试验进行鉴定。1983年R.A.Van.Deusen介绍了NI试验的一种改进法-平板微量NI试验，此法虽不能提供常量法的定量，但却是A型流感病毒的病毒分类和抗体检测的快捷方法。试验证明，微量NI试验能对分离物做出准确鉴定，而常量M试验检测亚型混合物更敏感。目前很多兽医实验所己将微量NI试验列为流感病毒分离物定型及筛选畜禽血清9型NA抗体的常规方法。此法快速，成本较低，重复性好。这种技术的可靠性将导致NI试验的广泛应用。

2.4 病毒中和试验(VNT) 用VNT来鉴定或滴定禽流感病毒时，可以鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒的VNT相同，一般常用给定病毒稀释血清法：用100EID50或1000TCID50的病毒与RED处理过的倍比稀释的血清等量混合，室温作用1h，每枚鸡胚（9～11日龄）或每瓶细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4个胚或细胞瓶，37℃培养72h至7d，检查接种鸡胚尿囊液的血凝活性或血细胞吸附作用的最高稀释度即为中和抗体滴度。中和试验因其操作繁琐，耗时耗料，所以临床上几乎不用。但中和试验作为经典的方法在病毒鉴定中起很重要的作用，许多新的检测方法都要以此标准来进行比较。

2.5 免疫荧光技术(IFT) IFT的基原理是用荧光素标记的抗体仍能和相应的抗原形成免疫复合物，这种复合物由于有荧光素的参与，借助于荧光显微镜能观察到细胞内病毒抗原及其存在的位置，从而检测病毒抗原。早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。IFT的敏感度同病毒分离相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离，应用IFT通过单克隆抗体可检测A型流感病毒(H1N1)血凝素的抗原变异情况。IFT用于诊断，应注意避免或降低标本中出现的假阳性(及非特异性荧光抗体)问题。免疫荧光用于禽流感的诊断具有快速(2h之内)、特异和敏感性高的特点，但是其不能鉴别HA和NA亚型，而且需要特殊的设备(荧光显微镜)，受主观影响大需工作人员需具有一定的经验，所以在基层检测单位推广应用具有一定的局限性。

2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA具有无可比拟的敏感性，其基本原理是将抗原或抗体吸附到固相载体的表面，并仍能保持其免疫活性。抗原或抗体与酶所形成的结合物各自保持其免疫学活性和酶的催化活性。结合物与相应的抗体或抗原反应后，免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质，可用肉眼观察。由于反应颜色的深浅与相应抗体或抗原的量成正比，故可对抗体或抗原进行定量测定我国建立的禽流感间接ELISA和禽流感抗体斑点诊断技术，即可用于早期诊断，又可用于抗体的监测。斑点ELISA结果易于判定，特别适合现场禽流感抗体检测及流行病学调查。ELISA具有特异、敏感、快速、简便、易于标准化、便于大批量检测的优点使其得到快速发展和广泛应用。

3 禽流感分子生物学诊断技术

3.1 常规RT—PCR技术 该方法的基本原理是：从病料或者鸡胚尿囊液中提出禽流感病毒的RNA作为模板，加入所设计的引物，反转录酶及dNTP，在适宜的缓冲液及温度下合成cDNA。再以cDNA为模板，加入设计的上、下游引物，在DNA聚合酶作用下利用dNTP在PCR仪上合成新的DNA链，扩增过程以变性、退火、延伸为一个循环，经35个左右的循环，扩增产物的量已足够用琼脂糖凝胶电泳检测。该方法能直接检出病毒基因，较病毒分离快。但是，容易出现假阴性和假阳性以及出现非特异性扩增带、片状带或涂抹带现象。应注意控制好环境污染问题，核酸的提取和凝胶电泳要在不同的环境中操作，要及时清理PCR产物和电泳后的废弃物，避免PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。

3.2 实时荧光定量RT—PCR 实时定量RT-PCR是以常规PCR、核酸杂交和信号放大结合的实时、在线检测的定量PCR技术，主要分为利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物增加的探针类，用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加非探针类两种。已应用于禽流感检测的主要是基于Taqman技术，其原理是Taqman探针的5'端标记一个荧光分子，3'端标记一个荧光淬灭分子，当探针完整时，两者可发生荧光共振能量传递(FRET)。当PCR扩增时，由于Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针水解，使荧光分子与淬灭分子间距增大，从而破坏其FRET，则荧光监测系统能检测到荧光信号。每扩增一条DNA，就多一个荧光分子，随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长。该技术比常规PCR更快，更灵敏，特异性更强。用此法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量，因此得到较广泛的应用。此法早已在2004年作为国家标准发布，被应用于出入境检验检疫系统和大型禽肉出口企业。

3.3 依赖核酸序列的扩增技术 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术。该技术使用三种酶(AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶)以及2条特定引物共同协作完成。在设计NASBA引物时，使一个引物的5′端带有T7RNA，另一个引物的5′端序列含有与钌标的电化学检测探针(ECL p robe)互补的序列聚合酶识别的启动子序列，通过光电信号的检测作出靶RNA的定性、定量研究。其特点是整个反应在恒温条件下进行，不需特殊仪器，不需温度循环，大大避免了PCR过程中复杂的温度变化。与RT-PCR比较，在同一时间内NASBA拥有更高的扩增效率，并且可减少样品中抑制性物质的影响，降低核酸污染的可能性，检测时间缩短2.5h。这个分析检测方法灵敏度高、特异性强、易于操作，而且在检测过程中与临床相关的病毒无交叉反应能力，为确定疫情和采取防范措施争取了宝贵时间。

3.4 基因芯片技术 由于流感病毒拥有众多的型和亚型，无论是现存的那一种诊断方法，都无法同时对所有的流感病毒进行精确的分型。基因芯片技术可以对成千上万个基因进行检测，它的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。禽流感基因芯片技术是一种比较系统、完善的检测技术。原理是将大量的核酸分子探针以大规模阵列形式排布在很小的载玻片等载体上，通过与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。该方法的建立不仅有助于禽流感疫情各种亚型的有效监控，而且可以在第一时间内准确的发现新变异或基因重排的新亚型病毒。

4 结语

禽流感的传统检测诊断技术随着现代分子生物学、微生物学、免疫学等学科的飞速发展，以及同其它学科间的渗透与结合，禽流感技术一定会取得新的进展，实现诊断的快捷、方便、准确、灵敏、经济、易操作，为禽流感的防治做出重大贡献。

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