三种针法对快速老化痴呆模型小鼠老化度评分及行为学影响研究

罗本华　张雪竹　赵岚　张荣超　韩景献　于建春

阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是伴随机体衰老而出现的神经系统慢性、退行性病变，临床上以记忆减退、认知障碍和人格改变为特征。快速老化痴呆模型小鼠(senescence-accelerated mice prone 8, SAMP8)是自然发病的老年性痴呆模型，与同源的抗快速老化亚系小鼠(senescence accelerated mouse resistance 1，SAMR1)比较有明显的老化特征，老化评分明显增高，也存在明显的学习记忆障碍。本实验以SAMP8为研究对象，SAMR1为正常对照，以本课题组有长期临床与实验研究基础的“益气调血、扶本培元”针法(针刺腹穴组)为基础干预方法，又拟以动物试验先行背俞穴组及腹背配穴组的干预方法，检测SAMP8痴呆动物模型的老化评分及水迷宫行为学的影响，比较研究三种不同干预针法的疗效异同，进行“从三焦气化失司论治痴呆”及“益气调血，扶本培元”治则为基础的配方组穴优选方案探讨。

1　材料和方法

1.1　研究对象

健康雄性8月龄SAMR1 12只和雄性8月龄SAMP8 60只，由天津中医药大学第一附属医院动物中心提供(天津中医药大学第一附属医院动物中心自繁殖，自己应用，没有批号)。

1.2　动物分组

所有实验动物共分6组。按随机数字表法随机将60只SAMP8分为5组，即SAMP8对照组12只、针刺腹穴组12只、针刺背俞穴组12只、针刺腹背穴组12只、针刺非穴组12只，以及12只SAMR1为SAMR1对照组。

实验前各组小鼠的出生天数与体重因素比较如下：(1)出生天数均为8月龄，经方差分析显示各组间差异无统计学意义。(2)SAMR1对照组平均体重为(33.58±1.04)g，SAMP8对照组(29.4±1.85)g，针刺腹穴组(30.05±1.32)g，针刺背俞穴组(30.05±1.04)g，针刺腹背穴(29.86±1.58)g，针刺非穴组(29.7±1.89)g。t检验显示SAMR1小鼠与SAMP8小鼠比较P≤0.01，差异有统计学意义，SAMR1有体重优势；而单因素方差分析显示SAMP8各组间差异无统计学意义，提示SAMR1小鼠存在体重优势，可能对水迷宫成绩有一定的影响。SAMP8的体重差异是由SAMR1基因自然变异经筛选出的SAMP8系列，是群体固有的，二者是国际公认两种研究对照鼠模型。

1.3　处理方法

针刺腹穴组选取膻中、中院、气海及双侧血海、足三里，穴位定位根据《动物针灸穴位图谱》[1]。针刺方法：膻中、中脘、气海、足三里穴分别施捻转补法30秒，血海穴施捻转泻法30秒。针刺背俞穴组选取双侧肺俞穴、脾俞穴和肾俞穴，均针0.05～0.1 cm，分别施捻转补法30秒。针刺腹背穴组是取以上腹穴和背俞穴组，按以上操作。针刺非穴组取双侧胁下固定非穴点，作为对照刺激点，行平补平泻捻转手法各30秒。SAMP8对照组和SAMR1对照组施加与针刺组相同程度的捉抓。各组每天做相应处理1次，第8天停1次，连续14次。第15天休息1次，第16天上下午各行水迷宫训练1次，每次90秒；接下来10天每天均先行针刺相应穴位及相应治疗后，休息至少1小时以上，接着每隔4小时各做水迷宫1次，每天行2次水迷宫治疗。

1.4　实验方案

1.4.1老化度评分老化度评分标准依外在形体及行为的老化改变，客观地给动物评分。包括反应性、被动性逃避反应、皮毛光泽、皮毛粗糙程度、脱毛程度、皮肤溃病、眼周损害、角膜混浊、角膜溃疡、白内障、脊柱后凸等11项指标，每项指标再划分为3～5级不同等级，标定分值。积分越高则老化度越高。

1.4.2行为学测试Morris水迷宫参照文献制作[2-4]。实验时，一摄像头置于水迷宫水池中央的上方约2 m处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统(中国医学科学院药物研究所提供)自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、不同象限的停留时间、穿越原平台的次数、初始角度及游泳路线的长度、搜索策略及中、外环游泳距离百分比等参数。水迷宫实验方法与操作参考文献进行[5]。试验前1天，让动物在不含平台的水池中自由游泳90秒，上午、下午各一次，使其熟悉迷宫环境；实验程序包括第1至第5天共5天的隐蔽平台试验，第6天为探索试验，第7至第9天共3天反向试验及第10天的可视平台试验[5-6]，以评价SAMR1和SAMP8学习记忆能力的变化。

1.5　数据处理与统计分析

老化度评分数据处理：使用SPSS 13.0统计软件处理，采用ANOVA方差分析。P≤0.05为检验显著性差异水准。

实验后由于各组有不同数量的小鼠脱落，最后统计数据为SAMR1对照组12只、SAMP8对照组10只、针刺腹穴组10只、针刺背俞穴组11只、针刺腹背穴11只、针刺非穴组10只。

2　结果

2.1　老化度评分

实验前后SAMP8各组和SAMR1的老化度评分结果见表1。

治疗前老化评分值经单因素方差分析方差为F(5,58)=59.365，P<0.01，组间差异有统计学意义，SAMP8各组间两两比较差异无统计学意义。SAMR1对照组与SAMP8各组比较P<0.01(t检验结果相同)，而SAMR1评分明显低于SAMP8各组，说明8月龄的SAMR1小鼠衰老程度低于8月龄SAMP8小鼠，且从老化评分看，SAMP8小鼠已呈现迅速老化特征。

治疗后老化评分经单因素方差分析，F(5,58)=64.81，P<0.01，组间差异有统计学意义，而诸组间两两比较显示，SAMR1对照组与SAMP8各组比较均

表1　实验前后SAMP8和SAMR1的老化度评分结果

注：与SAMP8对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与针刺非穴组比较，cP<0.01；与SAMR1对照组比较，dP<0.01

P<0.01；而针刺腹穴组、针刺腹背穴组分别与SAMP8对照组和针刺非穴组比较，均P<0.01，差异有统计学意义；针刺背俞穴组与SAMP8对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义，而与针刺非穴组比较差异无统计学意义；三种针方法间差异无统计学意义。三种针刺组自身前后经配对t检验示：针刺腹穴组治疗后老化分值降低(t=2.862,P<0.05)，差异有统计学意义；针刺腹背穴组治疗后老化分值降低，差异有统计学意义(t=3.194,P<0.01)；针刺背俞穴组(t=2.170,P>0.05)治疗前后老化分值差异无统计学意义。SAMP8对照组和针刺非穴组实验处理前后没有变化。以SAMP8对照组为对照，针刺腹穴组、针刺背俞穴组及针刺腹背组三种针刺治疗后老化分值均有不同程度的降低。因此，三种针刺方法均对抵抗SAMP8小鼠快速老化进程及改善老化评分有一定的作用， 腹穴和腹背穴针刺组有相对肯定的疗效优势。

2.2　行为学研究结果

2.2.1隐蔽平台试验在连续5天(第1天至第5天)的隐蔽平台试验中，双因素方差分析检验结果为F(5,58)=12.447，P<0.01，所有8月龄SAMR1和SAMP8小鼠的逃避潜伏期均随训练天数的增加而明显缩短，学习成绩稳步提高，反映针刺治疗和水迷宫的训练有显著性的改善学习和记忆作用；交互作用检验为F(20,232)=1.016，P<0.05，说明训练天数与组间因素没有交互作用；而诸组间总体比较的方差为F(5,58)=23.188，P<0.01，说明诸组间总体有显著性差异。诸组间详细两两比较发现：(1)SAMP8对照组的平均潜伏期下降缓慢而SAMR1对照组下降明显，于第二天二者就出现显著性的差异；(2)三个针刺组中，针刺背俞穴组最早于第二天出现比SAMP8对照组和针刺非穴组更短的显著性差异平均潜伏期，但此后疗效不稳定；(3)从第3天到第5天，针刺腹穴组和针刺腹背穴组的逃避潜伏期均较SAMP8对照组和针刺非穴组更短，有显著性差异，且疗效稳定，而SAMP8对照组与针刺非穴组没有差异；(4)虽然三个针刺组间，平均潜伏期时间呈现“针刺腹背穴组<针刺腹穴组<针刺背俞穴组”的趋势。实验结果提示：SAMP8小鼠存在学习记忆获得方面的认知损害，而三个针刺方法都能显著地改善这种认知功能损害且具有穴位特异性；其中，针刺背俞穴组起效早但疗效不稳定。由此，课题组认为针刺腹穴组、针刺腹背穴组是可能的优选方法。各组小鼠在水迷宫中的平均逃避潜伏期时间见表2第1天至第5天数据。

2.2.2反向试验反向试验见表2第7天至第9天数据。在连续3天的反向试验中，双因素方差分析检验结果为F(5,58)=4.732，P<0.05，所有8月龄SAMR1和SAMP8小鼠的逃避潜伏期时间均随训练天数的增加而逐渐下降趋势，再学习成绩稳步提高，反映针刺治疗和水迷宫的训练有显著性的改善再学习和记忆作用；交互作用检验为F(10,116)=1.342，P<0.05，说明训练天数与组间因素之间没有交互作用；而诸组间总体比较的方差为F(5,58)=4.02,P<0.01，说明诸组间总体差异有统计学意义。组间因素详细两两比较发现：(1)SAMP8对照组和针刺非穴组的逃避潜伏期时间下降缓慢，而SAMR1对照组下降显著；于第8天，SAMP8对照组的逃避潜伏期比SAMR1对照组、针刺腹穴组均长，差异有统计学意义；(2)于第9天，针刺腹背穴组的平均潜伏期也比SAMP8对照组和针刺非穴组更短，差异有统计学意义(P<0.05)；(3)三个针刺组中，针刺腹背穴组和针刺腹穴组的平均潜伏期均较针刺背俞穴组更短，差异有统计学意义。反向试验结果提示：SAMP8小鼠存在记忆巩固和再学习能力的损害，这三种针法均能显著的改善这种认识功能损害，并显示穴位特异性，其中，针刺腹穴组显示更快和更稳定的作用。

图1显示水迷宫中隐蔽平台与反向平台试验中各组小鼠平均逃避潜伏期的变化趋势。在隐蔽及反向平台试验中，代表各组小鼠学习成绩的逃避潜伏期时间均随训练天数的增加而有明显缩短的趋势；SAMP8对照组(同样针刺非穴组)的逃避潜伏期时间下降缓慢而SAMR1对照组下降明显。

2.2.3空间探索试验实验动物在原平台象限停留时间见表2第6天数据。单因素方差统计显示F(5,58)=9.194,P<0.01，说明诸组间差异有统计学意义；SAMP8对照组(同样针刺非穴组)比SAMR1对照组短(P<0.05)，针刺腹背穴组(P<0.01)、针刺腹穴组(P<0.01)、针刺背俞穴组(P<0.05)三个针刺组均比SAMP8对照组和针刺非穴组更长；且针刺腹背穴组(P<0.01)和针刺腹穴组(P<0.01)均比针刺背俞穴组长。在穿越原平台的次数上，组间差异有统计学意义(F(5,58)=5.922,P<0.05)；SAMP8对照组(同样针刺非穴组)比SAMR1对照组穿越原平台次数(P<0.05)更少，且差异有统计学意义；而针刺腹背穴组(P<0.01)、针刺腹穴组(P<

图1　隐蔽、反向及可视平台试验中各组小鼠平均逃避潜伏期的趋势图

0.01)、针刺背俞穴组(P<0.05)三个针刺组均比SAMP8对照组和针刺非穴组次数多。实验结果提示SAMP8小鼠记忆保持能力方面有损害，三种针刺方法均能显著地改善这种认知损害，且有穴位特异性。Gallagher M(1993)等[8]确定的探索试验空间学习能力标准为：如果小鼠在原平台象限停留时间超过总时间的三分之一和穿越原平台超过2次，就说明该小鼠学会了平台的空间定位。以此为标准，与正常SAMR1(在原平台象限停留时间20.79秒,穿越原平台2.33次)小鼠相比，SAMP8(13.64秒,1.05次)小鼠存在学习记忆保留能力的损害；而在三个针刺组中，针刺腹穴组小鼠(20.26秒,2.15次)和针刺腹背穴组小鼠(20.48秒,2.05次)已经学会了平台的空间定位，因而能更好地完成任务，而针刺背俞穴组小鼠(17.06秒,1.77次)与SAMP8针刺非穴组(13.79秒,1.20次)没有效果。

2.2.4可视平台试验在空间训练的第10天最后进行，见表2第10天数据。单因素方差分析结果为F(5,58)=1.71,P>0.05，六组间平均逃避潜伏期时间总体差异无统计学意义；但两两比较发现(表2)，SAMP8对照组、针刺非穴组及针刺背俞穴组均比SAMR1对照组更长，均有显著性差异，这主要归因于与同龄SAMR1小鼠比较，8月龄SAMP8小鼠逃避危险水域的动机明显下降[9]，这是8月龄SAMP8小鼠学习成绩较差的一个重要原因；而针刺腹背穴组及针刺腹穴组平均逃避潜伏期时间，介于SAMP8对照组和SAMP1对照组之间，且与SAMP8对照组比较，差异无统计学意义，和SAMP1对照组比较，差异也是无统计学意义的，说明针刺腹背穴及针刺腹穴两种方法在一定程度上可增强SAMP8小鼠逃避危险水域的动机，降低平均逃避潜伏期时间，这也是该二种针法改善学习记忆的重要原因之一。对运动速度的单因素分析显示，六组总体比较F(5,58)=2.58,P<0.05，组间差异有统计学意义；两两比较发现，SAMR1对照组较SAMP8诸组均更快，且差异有统计学意义，而SAMP8诸组间差异无统计学意义，说明8月龄SAMP8鼠在运动速度、运动能力上比同龄SAMR1鼠要更差，这可能对动物空间学习记忆会产生一定的影响。可视平台试验提示：8月龄SAMP8小鼠运动速度、运动能力和逃避危险水域的动机对空间学习记忆有重要的影响。

2.2.5空间搜索策略空间搜索策略分析也能反映小鼠思考、分析和判断的差别，定性地支持水迷宫参数的结论。典型的空间搜索策略是小鼠的逃避潜伏期时间接近当日的平均值。水迷宫中，游泳轨迹被当作小鼠的搜索策略。在第1天，所有组小鼠采用边缘式和随机式碰触平台，游泳的轨迹要么沿池边的大圈，或者随机地横过某一象限。在第3或第5天，SAMR1组更多地通过直线式，SAMP8对照组通常通过边缘式和随机式碰触平台，更多针刺组的小鼠通过趋向式和直线式找到平台，而针刺非穴组更多地采用边缘式和随机式；故通过持续的针灸和水迷宫的训练，使三个针刺组均能更快地搜索到目标， 搜索策略趋向于SAMR1， 也体现穴位的

表2　各组小鼠在水迷宫中平均逃避潜伏期时间

注：第6天数据为在原象限的停留时间，而其他天的数据为逃避潜伏期时间。与SAMP8对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与针刺非穴组比较，cP<0.05，dP<0.01；与SAMR1对照组比较，eP<0.05，fP<0.01；与针刺背俞穴组比较，gP<0.05。

相对特异性。在探索试验中，在SAMR1对照组和三个针刺组的小鼠采用在每一象限的中心来回地寻找平台，而SAMP8对照组和针刺非穴组小鼠则表现沿池壁游走的搜索平台。提示三种针刺方法能够改善SAMP8边缘模式到随机模式或到直线模式，因而提高了SAMP8鼠的分析和判断能力，改善了搜索策略。

3　讨论

8月龄SAMP8存在明显的全面老化现象，但目前尚无针刺对SAMP8老化评分影响的研究，本研究首次显示基于“益气调血，扶本培元”基本治则的腹侧配穴、背俞穴配穴及腹背配穴的三种针刺方法均能明显降低SAMP8的老化评分，提示三种针法均能改善SAMP8小鼠的老化度，说明有改善衰老认知的功能；但针刺腹穴组与针刺腹背穴组自身前后比较降低有统计学意义，而针刺背俞穴组的降低无统计学意义，提示在改善老化认知功能上，针刺腹穴组和针刺腹背穴组更具疗效优势。

当前，尚无“益气调血、扶本培元”治则不同针刺取穴方法对SAMP8小鼠认知功能影响的研究报告。Morris水迷宫隐蔽平台主要反映学习的能力，而反向平台试验反映再学习的能力，结果均说明针灸治疗与水迷宫训练天数的增加可显著性地提高小鼠学习成绩，说明三种针刺方法均有改善认知障碍的功能，但三种不同针刺干预方法的作用呈现显著性差异，体现其针法的疗效差异；SAMP8小鼠(对照组)学习时间比SAMR1小鼠要长，并且平均逃避潜伏期时间下降缓慢，在多天的学习、记忆的治疗训练中体现其学习与再学习能力差，即是认知功能障碍。在学习能力上，SAMP8小鼠针刺背俞穴治疗及训练呈现学习成绩改善最快但不稳定特点，而针刺腹穴治疗及针刺腹背穴治疗训练的学习成绩改善较稳定的特点；在再学习方面，SAMP8针刺腹穴方法起效最快，并显著性地优于另二种针法。探索试验主要反映动物记忆保持能力，结果提示SAMP8小鼠在记忆保持能力方面也有损害，三种针刺方法均能增加在原平台象限的停留时间和在穿越原平台的频次，均能显著地改善这种记忆保持能力的认知损害，疗效有穴位特异性。可视平台试验反映出SAMP8存在运动速度、能力以及逃避水域的动机降低的特点，而实验不同针刺方法治疗作用及成绩提高均体现能一定程度增强SAMP8小鼠逃避水域的动机，并在定性体现出逃避动机的搜索策略上相应的改善。本实验综合分析特点有：三种针法均有改善SAMP8小鼠衰老的作用，但程度有差异；均能较全面改善SAMP8小鼠认知功能，但改善的方面与程度各具特点。综合考虑三种不同针法在作用于老化度评分及水迷宫实验结果，本实验支持优选原有“益气调血、扶本培元”针法。

如果结合三种不同针法用穴特点分析，可能对三种针法实验结果及筛选有一定的启示作用。(1)背俞穴是脏腑之气输注于背腰部的腧穴，背俞穴组方也是基于“从三焦气化失司论治痴呆”及“益气调血，扶本培元”基本治则，配穴组方侧重从背侧调理上中下三焦的肺脾肾三脏及三脏气化。而实验说明背俞穴针刺有一定的改善SAMP8认知功能，但“益气调血、扶本培元”针法更具优势，这可能与腹前针法为上中下“三海”穴有密切有关，人体“四海”统御着脏腑、经络气血的整体功能，整体调理全身气血水津液精的生化及代谢，能更好地体现并实现三焦气化的功能。(2)“益气调血、扶本培元”针法与其配合背俞穴针刺方法之间疗效没有显著性差异，腹部穴配取背俞穴也未显示的叠加疗效，而在反向平台试验中，“益气调血、扶本培元”针法起效更快，疗效稳定，相对有一定的疗效优势，且从取穴多寡考虑，取穴少者更有利于“治神”，目前动物实验的结果支持优选“益气调血、扶本培元”针法。

实验结论为：三种不同针法都能抵抗SAMP8快速老化进程和降低老化度评分，也均能改善SAMP8认知功能障碍，而改善特点不同；综合起来，动物实验支持原有“益气调血、扶本培元”针法。

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