十二烷烃降解菌的筛选，鉴定及降解条件的优化

杨姣英，张玉霞，蒋林时

（辽宁石油化工大学 环境与生物工程学院， 辽宁 抚顺 113001）

随着石油工业的发展，石油在开采，运输，装卸，加工和使用的过程中，由于泄露和排放，引起土壤的污染，造成土壤的盐碱化，毒化和废弃，甚至有毒物质通过农作物尤其地下水进入食物链，最终直接危害人类[1]。用物理方法治理土壤的石油污染的同时会破坏土壤的结构和组分，而且价格昂贵不易实施。使用化学的方法又会造成二次污染[2]。因此，利用生物修复技术治理石油污染的土壤的方法日益受到人们的重视[3]。石油烃中，烷烃占 90%左右，直链烷烃大约占15%～30%，是主要的污染物。不同的石油降解菌对不同的烃类分子的降解特性不同。本研究以正十二烷烃为唯一碳源，从辽河油田采油井附近被油污染的土壤中分离和筛选出一株可以高效降解烃类的微生物，并通过对其形态和生理生化特性的研究，初步做出鉴定，并通过改变培养条件，提高其降解性能。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源

采自辽河油田采油井附近长期被油污染的土壤中。

1.1.2 培养基配置

无机盐培养基：NaH2PO40.2 g，(NH4)2SO40.1 g，无水 CaCl20.02 g，NaNO30.1 g，MgSO47H2O 0.04 g，K2HPO40.2 g，用蒸馏水定容至0.2 L，用NaOH调节pH至7.0。

富集培养基：蛋白胨2.0 g，牛肉膏1.0 g，氯化钠1.0 g，用蒸馏水定容至0.2 L，用NaOH调节pH至7.0。

固体培养基：各培养基中加入 1.8%(质量分数)的琼脂。pH为7.0，高温湿热灭菌，倒平板或制成试管斜面。

十二烷培养基：无机盐培养基 120 ℃灭菌 20 min后加入正十二烷作为唯一碳源。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的筛选分离及鉴定

取由40目筛筛过的土壤2.0g，放入装有100 mL富集培养基的250 mL锥形瓶中，并加入0.07 mL正十二烷(锥形瓶内正十二烷浓度为 500 mg/L)，放在温度为35 ℃，转速为200 r/min的摇床里培养，每2 d接种一次，接种量为10%[4]，正十二烷浓度逐渐增加至1.0、1.5和2.0 g/L。当十二烷的浓度增加到2.0 g/L后，以10%的接种量接种到十二烷培养基中，十二烷的浓度为2.0 g/L。驯化培养4 d。配置正十二烷的浓度为0.5 g/L的，采用平板稀释法将驯化了4 d后的菌液涂布已配置好的无机盐固体平板培养基中，放到 35 ℃的恒温培养箱中培养一个星期后，挑选出菌型比较良好的单菌落在含正十二烷浓度为0.5 g/L的富集平板培养基上反复划线纯化直到纯菌种培养，保存菌种备用。

1.2.2 测定菌株的降解率

取纯化后保存的菌种活化，按接种量为10%取活化后的菌液加入正十二烷的浓度为0.5 mg/L的无机盐培养基中，为提高实验准确性，另取不接种的无机盐培养基作为空白对照。设定摇床的培养条件为温度35 ℃，转速200 r/min，连续培养2 d。然后离心菌液（转速3 500 r/min，离心20 min)，将上清液倒入锥形瓶中，先加入50%浓硫酸酸化，取适量的石油醚萃取2～3次，收集上层清液用无水硫酸钠脱水、过滤、定容，采用紫外分光光度计测定内正十二烷残留量，并计算正十二烷的降解率[5]。

1.2.3 测定菌株的生长量

取菌种活化，在不同的时间段用移液管移取锥形瓶中适量的菌液，在波长600 nm处用紫外可见分光光度计测定其吸光度值(OD600)，用去离子水做空白实验，以浊度表示菌体的生长量。

1.2.4 降解菌株的鉴定

通过观察菌体形态，菌落特征及生理生化特性实验，根据《常见细菌系统鉴定手册》[6]及《伯杰细菌鉴定手册》[7]鉴定菌种。

2 结果与讨论

2.1 降解菌株的筛选分离及鉴定

经过多次富集培养和筛选、分离与纯化，得到一株具有降解十二烷能力的菌株，命名为SHY1。

SHY1菌菌落较大，表面光滑，金黄色，边缘整齐的不规则短杆状，有鞭毛。革兰氏染色为阴性，具有硝酸盐的反硝化作用，可以利用明胶，氧化酶阳性，氧化葡萄糖产酸不产气，不能利用淀粉，M.R反应为阳性，吲哚反应为阴性V.P反应为阴性，接触酶实验为阳性。由以上生理生化特性推断，SHY1菌为假单胞菌属（Pseudomonas）。

2.2 培养时间对菌株的影响

将菌株按10%接种量接种于含500 mg/L正十二烷的90 mL富集培养基中，35 ℃、200 r/min摇床培养，定时取样。结果如图1所示。

图1 培养时间对菌株生长的影响Fig.1 Effect of cultivating time on the strain growth

在接种0～10 h，因菌种代谢系统需要适应新的环境，生长量(以OD600表示，下同)较低，为延滞期；在10～28 h时，该曲线上升趋势增大，菌种处于对数生长期；28～46 h，生长曲线趋于平缓，因为随着微生物大代谢繁殖，菌液中的营养物比例失调，代谢产生的有害物质大量积累，新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，进入稳定生长期；46 h后，生长曲线开始下降，单位时间内菌液中的细胞死亡数多于新生的细胞数，菌体进入衰败期。从该生长曲线上看，该菌适应和调整的时间比较短暂，这表明该菌的繁殖速度较快，有较强的繁殖能力，同时对数生长期较长，对实际应用较有利。

2.3 环境条件对正十二烷烃降解及菌株生长影响

2.3.1 接种量的影响

控制接种量分别为5%，10%，15%，18%，20%。在35 ℃条件下摇床培养72 h，测定菌株生长量和正十二烷降解率。根据实验所得的数据得到图2。

图2 接种量对菌株生长和正十二烷降解的影响Fig.2 Effect of inoculation on the growth of strain and degradation of dodecane

图2表明，接种量为5%～10%时，正十二烷的降解率和菌株生物量随接种量的增大而升高；当接种量为10%时，降解率达到最大值；接种量为10%～18%时菌体的生长量继续上升，但是正十二烷的降解率反而开始降低；接种量为18%～20%时菌体生长量开始降低，正十二烷的降解率继续降低。接种量的大小会影响延滞期的长短，接种量过小时，会使延滞期较长，菌体生长慢，从而影响正十二烷的降解率。但是，接种量过大则会使内部营养物的消耗加速，同时代谢产物积累过多，溶氧不足，毒性随之增强[8]。因此，从经济角度考虑，实际操作时采用接种量为10%时为最佳。

2.3.2正十二烷浓度的影响

分别以浓度为 100，200，500，1 000，1 500和2 000 mg/L的正十二烷，按10%接种量接种，在35 ℃条件下摇床培养72 h，测定菌株生长量和正十二烷降解率，根据实验所得的数据得到图3。

图3 正十二烷浓度对菌株生长和正十二烷降解的影响Fig.3 Effect of dodecane mass concentration on the growth of strain and degradation of dodecane

由图3可见，正十二烷浓度为500 mg/L时，正十二烷降解率和菌株生长量均较高，高于500 mg/L时，正十二烷降解率和菌体生长量都会随着浓度的增加而降低。因为随着正十二烷的浓度的增加，细菌数量大幅度增加，促进了对正十二烷的生物降解；但当正十二烷的浓度过大时，有可能阻碍了氧的传递，导致菌体不能良好生长，从而使降解率下降。因此，适合接种SHY1菌的正十二烷的浓度为500 mg/L。

2.3.3 pH值的影响

控制这pH分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，向各瓶中加入浓度为500 mg/L(0.07 mL)的正十二烷，按10%接种量接种，在35 ℃条件下摇床培养72 h，测定菌株生长量和正十二烷降解率。根据实验所得的数据得到图4。

图2-4表明：正十二烷的降解率在pH为4.0～8.0时，随着pH的不断增加而逐渐增大，在pH为8.0时降解率达到最大值，此后随着pH的增加又逐渐减小。所以该菌株在pH为8.0的弱碱性条件下对正十二的降解率比较高。过高或过低的初始pH对菌株的生长和正十二烷的降解都不利于。

图4 初始pH对菌株生长和正十二烷降解的影响Fig.4 Effect of initial pH on the growth of strain and degradation of dodecane

2.3.4 温度的影响

浓度为500 mg/L(0.07ml)的正十二烷，按10%的接种量接种，分别在25, 30, 35, 37, 40 ℃条件下摇床培养72 h以后，测定菌株生长量和正十二烷降解率。根据实验所得的数据得到图5。

图5 温度对菌株生长和对正十二烷降解的影响Fig.5 Effect of temperature on the growth of strain and degradation of dodecane

图2 -5表明：该菌种在温度为30～37 ℃时，菌体生长速度有所增加，且在 37 ℃时菌体生长量达到最高；温度低于30 ℃或高于37 ℃时，菌株的生长受到抑制，因此菌株的最适生长温度为37 ℃。

3 结 论

(1) 通过对辽河油田采油井附近长期被油污染的土壤进行驯化、筛选和分离，得到一株能够以正十二烷为唯一碳源进行生物降解的正十二烷降解菌(SHY1菌)。经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。

(2) 通过生长条件优化得出，SHY1菌株的最适生长条件是：培养基的初始pH=8.0，温度为37 ℃，接种量为10%。

(3) 在最适的条件下，当培养基中正十二烷的含量为500 mg/L时，在72 h内降解率可达65.2%。

［1］Tao Liu，Feng hua wang，Lan ping guo．Biodegradation ofn-hexadecane by bacterial strains B1and B2 isolated from petroleum-contaminated soil[J] . Science China Chemistry 2012，55(9)：1968-1975．

［2］邓绍云，徐学义，邱清华．我国石油污染土壤修复研究现状与展望[J].北方园艺，2012 (14)：184-190．

［3］李景全，肖盟，石布乾．生物强化技术在油田污水处理工程中的应用[J].油田化学，2011，28（3）：338-341．

［4］向丽君，陈双扣，余媛媛. 石油烃降解菌的筛选及其生长条件研究[J].工业安全与环保，2012，38（7）：65-67．

［5］王国惠．环境工程微生物学实验[M].北京：化学工业出版社，2011：111-113．

［6］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：128-132．

［7］布坎南，吉本斯．伯杰细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1998：274-280．

［8］Michail M Yakimov，Kenneth N Timmis，Peter N Golyshin. Obligate oil-degrading marine bacteria [J].Current Opinion in Biotechnology，2007，18（3）：257-266．