慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测及临床意义

邬艳波，蔡汉新，刘育琼，邓欣

(1.深圳市观澜人民医院感染科，广东深圳518110；2.深圳市龙华新区卫生监督所医疗机构监督科，广东深圳518110；3.深圳市第三人民医院肝病科，广东深圳518112)

慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测及临床意义

邬艳波1，蔡汉新2，刘育琼1，邓欣3

(1.深圳市观澜人民医院感染科，广东深圳518110；2.深圳市龙华新区卫生监督所医疗机构监督科，广东深圳518110；3.深圳市第三人民医院肝病科，广东深圳518112)

【摘要】目的探讨自身抗体阳性慢性乙肝(CHB)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的特点。方法自身抗体阳性的CHB患者20例、自身抗体阴性的CHB 20例、自身免疫性肝炎15例。用斑点免疫层析法检测其抗单链DNA抗体(ss-DNA)、抗双链DNA抗体(ds-DNA)、抗核抗体(ANA)、可提取核抗原抗体谱(ENA)、抗线粒体IgM抗体(AMA)。流式细胞术检测外周血中的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例，并与20例正常人对照组的上述指标进行比较。结果自身抗体阳性CHB组CD4+CD25+T细胞较正常人无减低(P＞0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+T细胞显著降低(P＜0.05)；与自身抗体阳性CHB比较，自身抗体阴性CHB组CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞均显著升高(P＜0.05)，而自身免疫性肝炎情况则相反。结论自身抗体阳性CHB患者Treg细胞功能较正常人显著降低，而且比自身抗体阴性CHB患者的Treg细胞数量及功能均偏低。这可能是自身抗体阳性CHB病情较重、反复发作的原因之一。

【关键词】自身抗体；慢性乙型肝炎；CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)除肝脏免疫病理损伤外[1]，也可导致肝外自身免疫现象[2]。伴有自身抗体阳性的慢性乙肝临床病情较重，易于复发，治疗棘手。自身抗体阳性CHB的免疫调节机制尚不很清楚。近来发现，调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)与CHB的发病有一定关系[3-4]。我们测定了20例自身抗体阳性慢乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，探讨Treg细胞在自身抗体阳性慢乙肝发病中的意义。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2011年8月至2012年7月观澜人民医院和深圳市第三人民医院门诊和住院的患者共55例，其中男性36例，女性19例，平均年龄38.1岁。所选CHB患者诊断符合2000年病毒性肝炎防治方案诊断标准，并排除其他肝炎病毒感染、重型肝炎、肝硬化失代偿。根据慢性乙肝患者有无自身抗体阳性(抗单链DNA抗体、抗双链DNA抗体、抗核抗体、抗可提取核抗原抗体谱、抗线粒体IgM抗体5项自身抗体中1项以上阳性者，为自身抗体阳性CHB，阴性者为自身抗体阴性CHB)分为自身抗体阳性的CHB、自身抗体阴性的CHB。自身免疫性肝炎(AIH)患者的诊断符合2002年美国肝脏病学会自身免疫性肝炎诊断标准。55例患者中依据以上标准分为自身抗体阳性CHB 20例、自身抗体阴性CHB 20例、自身免疫性肝炎15例。选取同期本单位健康工作人员20例为对照组，其中男性14例，女性6例，平均年龄32.5岁。

1.2主要仪器和试剂

1.2.1仪器流式细胞仪为美国BD公司FACSCalibur。全自动生化分析仪为OLYMPUS公司AU2700。

1.2.2试剂PC标记的抗CD4单克隆抗体和FITC标记的抗CD25抗体购自美国BD公司；PE标记的抗Foxp3抗体、细胞固定/破膜液及稀释液、缓冲液购自eBiolsciense公司，淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司，流式细胞仪(EPICS XL)为美国贝克曼-库尔特公司产品。

1.3方法

1.3.1自身抗体检测抗单链DNA抗体(ss-DNA)、抗双链DNA抗体(ds-DNA)、抗核抗体(ANA)、可提取核抗原抗体谱(ENA)、抗线粒体IgM抗体(AMA)检测均采用斑点免疫层析法，均按试剂盒说明进行操作，由本院检验科完成。

1.3.2外周血中CD4+CD25+T细胞及Foxp3+细胞比例检测所有被观察对象均于清晨空腹采集静脉血2 ml，EDTA抗凝，用PBS1：1稀释后，以淋巴分离液分离，获得单个核细胞。计数，调整细胞悬液浓度为1×107/ml，取100 μl(1×106个)PBMC分别加入PC-抗CD4、FITC-抗CD25抗体各20 μl，混匀，室温避。光孵育15 min，加入冷PBS洗涤1次，离心5 min，弃上清，加入新鲜配制的固定/破膜液1 ml，4℃避光反应30～60 min，用固定/破膜缓冲液2 ml洗涤2次，加入PE-抗Foxp3抗体20 μl，4℃避光作用30 min，用固定/破膜缓冲液2 ml洗涤2次，弃上清，加入0.5 ml PBS，混匀，用流式细胞仪检测，结果用CellQuest软件分析。以CD4+细胞和SSC门，选择CD4+细胞分析CD25和Foxp3表达。

1.4统计学方法所有数据用SPSS13.0软件处理。计量资料以均数±标准差表示。四组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1自身抗体阳性CHB患者自身抗体分布情况20例CHB患者中，ss-DN 6例，ds-DNA 6例，ANA5例，ENA2例，AMA1例。

2.2各组患者外周血PBMC中CD4+CD25+Foxp3+表达的比较与正常对照组比较，自身抗体阴性CHB组CD4+CD25+T细胞数显著增加(P＜0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+T细胞数无增加；自身免疫性肝炎组CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞均显著降低(P＜0.05)；自身抗体阳性CHB组CD4+CD25+T细胞无减低(P＞0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+T细胞显著降低(P＜0.05)，提示自身抗体阳性CHB患者Treg细胞功能显著降低。与自身抗体阳性CHB组比较，自身免疫性肝炎组CD4+CD25+T细胞数显著降低(P＜0.05)，自身抗体阴性CHB组CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞均显著升高(P＜0.05)，提示自身抗体阴性CHB的Treg细胞数量及功能均偏高，见表1。

表1　各组外周血CD4＋CD25＋T细胞和CD4＋CD25＋FoxP3＋细胞比较(%，)

表1　各组外周血CD4＋CD25＋T细胞和CD4＋CD25＋FoxP3＋细胞比较(%，)

注：a与正常对照组比较，P＜0.05；b与自身抗体阳性CHB组比较，P＜0.05。

组别自身抗体阳性CHB组自身抗体阴性CHB组自身免疫性肝炎组正常对照组例数20 20 15 20 CD4+CD25+T细胞5.66±2.21 8.56±3.72ab3.38±1.65ab6.93±2.83 CD4+CD25+Foxp3+21.28±2.47a29.16±5.32b19.37±2.53a27.87±4.36b

3　讨论

调节性T细胞(Treg)具有免疫抑制性和免疫无能性，其主要表现在CD4+CD25+Tregs经TCR刺激活化后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖。CD4+CD25+Tregs被活化后，其抑制作用即为非抗原特异性的，不具有MHC限制性。目前一般认为CD4+CD25+Tregs的作用机制有以下3种：①体外通过细胞间接触依赖机制发挥作用。CD4+CD25+Tregs可通过CTLA-4、TGF-β及GITR等与靶细胞上的相应受体结合，并抑制靶细胞上IL-2Rα链的表达，降低靶细胞对IL-2的反应性从而抑制效应T细胞的增殖[5]。②体内调节功能主要依靠抑制性细胞因子，如IL-10、IL-4及TGF-β。③CD4+CD25+Tregs还可通过与抗原提呈细胞的作用来调节机体免疫。研究表明活化后的CD4+CD25+Tregs可表达颗粒酶A，在细胞直接接触基础上，通过穿孔素依赖的细胞毒作用杀伤多种自体靶细胞[6]。

调节性T细胞表面表达特异性转录抑制因子Fox P3被认为是CD4+CD25+调节性T细胞发育及启动抑制功能的关键基因，其表达水平能更为精确地反映CD4+CD25+调节性T细胞的活性[7]。多数研究提示[8]： CHB患者体内的CD4+CD25+调节性T细胞数量或者功能异常，降低了机体的HBV特异性的效应性T淋巴细胞反应，使得HBV不能得到彻底清除，反复感染。然而，CD4+CD25+调节性T细胞在自身免疫性肝炎中的情况与慢性乙型肝炎中完全相反[9]。CD4+CD25+调节性T细胞下降可能是自身免疫性肝炎发病的原因之一。CHB患者存在血清自身抗体阳性的自身免疫现象，因此我们研究了自身抗体阳性慢乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数量，结果表明，自身抗体阳性CHB患者调节性T细胞功能较正常人显著降低，而且比自身抗体阴性CHB患者的调节性T细胞数量及功能均偏低，这可能是自身抗体阳性CHB病情较重，反复发作的原因之一。

参考文献

[1]曾东良,莫宝妹,姜焕好,等.自身抗体检测在慢性肝病诊断中的意义[J].海南医学,2011,22(20):117-119.

[2]李晓良,杨大国,林巧,等.1335例慢性乙型肝炎患者血清自身抗体检测分析[J].中西医结合肝病杂志,2006,16(3):162-163.

[3]Stoop JN,Molen RG,Baan CC,et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Hepatology,2005,41:771-778.

[4]郑林华,时永全,韩英,等.T淋巴细胞亚群与慢性乙型肝炎的关系[J].中华肝脏病杂志,2012,20(1):75-77.

[5]Camaara NO,Sebill EF,Lechle RR.Human CD4+CD25+regulatory cells have marked and sustained effects on CD8+T cell activation[J]. Eur J Immunol,2003,33(12):3473-3483.

[6]Grossman WJ,Verbsky JW,Barche TW,et al.Human Tregulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death[J].Immunity,2004,21(4):589-601.

[7]唐洁,李柏青,阮洁,等.新生儿脐带血CD4+CD25+high调节性T细胞Foxp3的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(4): 365-367.

[8]徐东平,福军亮,王福生,等.乙型肝炎患者外周血和肝组织FoxP3的检测及其意义[J].解放军医学杂志,2006,31(5):394-396.

[9]胥萍,李明,吴敏娟,等.自身免疫性肝病相关抗体与CD4+CD25+调节性T细胞的临床意义探讨[J].中国现代药物应用, 2008,2(3):1-3.

【中图分类号】R512.6+2

【文献标识码】A

【文章编号】1003—6350（2013）19—2872—03

doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2013.19.1197

(收稿日期：2012-12-26)

基金项目：深圳市宝安区科技计划项目(编号：20110704)

通讯作者：邬艳波。E-mail：wuyanbo1969@sina.com

Detection and clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in patients with autoantibody-positive chronic hepatitis B.

WU Yan-bo1,CAI Han-xin2,LIU Yu-qiong1,Den Xing3.1.Department of Infection,Shenzhen Guanlan People's Hospital,Shenzhen 518110,Guangdong,CHINA;2.Department of Medical Institution Supervision, Shenzhen Guanlan Health Supervision Institute,Shenzhen 518110,Guangdong,CHINA;3.Department of Hepatology, Shenzhen Third People's Hospital,Shenzhen 518112,Guangdong,CHINA

【Abstract】ObjectiveTo investigate the features of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell in patients with autoantibody-positive chronic hepatitis B.MethodsTwenty patients with autoantibody-positive chronic hepatitis B (CHB),20 patients with autoantibody-negative CHB,and 15 patients with autoimmune hepatitis(AIH)were selected as research subjects,and 20 healthy people were taken as the control group.Anti-single-stranded DNA antibody (ss-DNA),anti-double-stranded DNA antibodies(ds-DNA),antinuclear antibody(ANA),extractable nuclear antigens antibody(ENA),anti-mitochondrial IgM antibodies(AMA)were detected by dot immuno-chromatography.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells were measured by using flow cytometry.ResultsCompared with healthy people,CD4+CD25+T cells of autoantibody-positive CHB patients showed no significant decrease(P＞0.05),while CD4+CD25+Foxp3+T cells reduced significantly(P＜0.05).In comparison with autoantibody-positive CHB patients,CD4+CD25+T cells and CD4+CD25+Foxp3+T cells in autoantibody-negative CHB patients increased significantly(P＜0.05),while those in patients with AIH were on the contrary.ConclusionRegulatory T cells of patients with autoantibody-positive CHB are significantly lower than healthy human.Furthermore,the number and function of regulatory T cell of patients with autoantibody-positive CHB are lower than those of autoantibody-negative CHB patients.This is probably one of the reasons why autoantibody-positive CHB patients are more severe and recurrent.

【Key words】Autoantibody;Chronic hepatitis B(CHB);CD4+CD25+Foxp3 regulatory T cell