海洋活性物质2，3-吲哚醌对雄性大鼠生殖系统的作用研究

宋丽阳 彭晓娉 王 珏 岳 旺 张继国

(1．青岛大学医学院药理教研室，青岛 266021;2泰山医学院药理教研室，泰安 271016)

生育对人类物种延续起着核心的作用，自工业化以来，环境污染加剧，人类长期暴露于物理化学因素下，生育能力受到威胁。近年来，不育症发病率逐渐增高，目前现代医学对诸如精子异常等引起的男性不育症尚无理想药物治疗，临床上对于生精障碍的治疗及精子的保护多是一些经验方，有效成分及作用机理尚待阐明。2，3-吲哚醌(ISA)，系海洋天然生物活性物质，该物质是维持龙虾生存的物质［1］，近年来又发现其是存在于人和动物体内的一种内源性活性因子［2，3］。已证实 2，3-吲哚醌具有保护神经、抗炎、抗菌、抗病毒等作用［4，5］，在离体和活体证明了其抗衰老、抗氧化作用机制等活性，而对其男性生殖保护作用未见报道，本研究重点通过精子数目、精子活动力、性激素、睾丸生精细胞等指标观察药物治疗效果，为探讨ISA生物学机制奠定实验基础，为研发ISA在治疗生殖系统疾病新药方面提供新思路。

1 ． 实验材料与设备

1．1 主要试剂

环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号12010525);促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所，批号120220);甲醛(分析纯)(嘉城精细化学品有限公司，批号201108);二甲苯(分析纯)(南京化学试剂有限公司，批号12020710153);乙醇(分析纯)(南京化学试剂有限公司，批号:11071010825);果糖(上海强顺化学有限公司，批号2000801);胎牛血清(HYCLONE，批号:NTM0133)。

1．2 主要仪器设备

组织切片机(LEICA，型号 RM2135);烤片机(中威电子仪器有限公司，型号RHY-III);普通双目光学显微镜(Olympus Optical Co．，Ltd．型号CHL);γ-多管放射免疫计数器(众成机电，型号DFM-96);低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，型号KDC-1042);水浴箱(新苗公司，型号HSWX-4208S);普通天平(上海医疗器械，型号14M3);聚乙烯圆底试管(振中医疗器械有限公司，批号20110922);微量加样枪(Thermo scientific公司，型号HH47927)。

1．3 实验动物

80只清洁级雄性wistar大鼠，13周龄、性成熟，300～350 g，普通饲料，均由青岛药检所提供。

1．4 实验方法

1．4．1 药品配制

① 环磷酰胺为0．2 g每支，粉剂，每支使用10 ml 0．9%NaCl溶解，现用现配，2小时内使用。

② ISA溶液的配制:首先配制1．25%西黄耆胶水溶液，然后以1．25%西黄耆胶水溶液为溶剂，分别配制ISA低浓度3 mg/ml、中浓度15 mg/ml、高浓度30 mg/ml，3～5℃冰箱保存，有效期3天。

1．4．2 动物分组与给药

将80只雄性wistar大鼠正常饲养一星期后，随机分为正常对照组、模型组、ISA低剂量治疗组、ISA中剂量治疗组、ISA高剂量治疗组，每组16只。

利用环磷酰胺腹腔注射制作大鼠不育模型，该方法操作简单、易控制、便于获取、便于观察且效果好［6］。① 正常对照组:按30 mg/kg·d给大鼠腹腔注射生理盐水，连续5天，第6天开始，给正常对照组大鼠每天生理盐水灌胃，灌胃量为1 ml/100 g，持续35天。②模型组:按30 mg/kg·d体重给大鼠腹腔注射环磷酰胺，连续5天，第6天开始，给模型组大鼠每天1．25%西黄耆胶水溶液灌胃，灌胃量为1 ml/100 g，持续35天。③ 低中高剂量组:按30 mg/kg·d给各药物组大鼠腹腔注射环磷酰胺，连续5天，第6天开始，分别给低、中、高剂量药物组大鼠不同剂量的2，3-吲哚醌，低剂量组以30 mg/kg、中剂量组以150 mg/kg、高剂量组以300 mg/kg给药，灌胃量为1 ml/100 g。灌胃，持续35天。

1．4．3 给药阶段结束时各组实验鼠数目

给药阶段结束时，模型组、低剂量药物组各死亡实验鼠1只。在第36天，每组中随机抽取6只大鼠单独饲养，以备后续实验，其余动物处死、取材。各组实际数目为正常对照组10只，模型组9只，低剂量药物组9只，中剂量药物组10只，高剂量药物组10只。

1．4．4 标本采集

①血清标本采集:灌胃持续35天后，实验第42天，大鼠麻醉后颈部剃毛，断头取血，避免血标本接触老鼠体毛，可有效防止溶血［7］。普通干试管(无抗凝剂、促凝剂)，取血3 ml以上，离心机，3000转/分钟离心(1728g)15 min，取血清－80℃低温保存，待测睾酮(T)、促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)。②睾丸、附睾取材:附睾37℃气浴保存备用。睾丸称重，记录。睾丸组织甲醛处理:睾丸注射10%甲醛预处理30 min，用10%甲醛浸泡7天。③胸腺、肝、脾取材:大鼠处死后，打开腹腔，在解剖位置的右侧取肝，左侧取脾。打开胸腔。胸腺位于心脏上方，左右肺之间，白色，小心剥离。④ 精子取材:配置精子抚育液:137 mmol/L NaCl，2．8 mmol/L KCl，1．0 mmol/L MgCl2，12 mmol/L NaHCO3，0．4 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L HEPES 缓冲液，5．5 mmol/L 果糖，0．35%BSA(w/v)，pH=7．4。把完整单侧附睾用37℃生理盐水冲洗，浸泡15 min，减少组织取材时携带的血细胞，把附睾浸入1 ml自配精子抚育液，剪碎，200目筛过滤，分开精子与组织残片，备用，待用时间30 min内。

1．4．5 标本检测

1．4．5．1 称重

睾丸，胸腺，肝，脾取材后称重将标本用吸水纸擦拭，用天平称量，结果记录。

1．4．5．2 精子检测

①精子计数:将一侧附睾置于1 ml自配精子抚育液中剪碎，过滤，混匀后用微量加样枪吸取10 μl精子悬液，加入990 μl精子孵育液中，即稀释100倍。混匀，再吸取稀释后精子悬液，加在血细胞计数板上，光镜下，用红细胞计数法计数，高倍镜下计数精子总数。精子计数/μl=R×25×10×稀释倍数，即可推算出单侧附睾精子悬液每毫升精子数量。

②精子活动力检测:稀释100倍的混匀精子悬液，吸取10 μl，加在血细胞计数板上，光镜高倍镜下选择多个视野，观察200个精子的活动情况。注意整个操作和观察在室温20～22℃，10 min内完成。根据精子分类法，将精子活动力分为 a、b、c、d级。精子活动力分级:a级为快速向前运动，b级为缓慢或呆滞前向运动，c级为非前向运动，d级不动。

1．4．5．3 血清标本检测

血清检测T、FSH、LH，采用放射免疫检测，竞争法，分别根据相应试剂盒步骤操作［8］。

1．4．5．4 睾丸组织切片HE染色观察

大鼠睾丸切片HE染色，光镜下观察生殖细胞层数，制片后生精小管因挤压，大多呈椭圆型，长短轴比较大。为便于观察生殖细胞层数，数据皆取长轴侧值。

1．5 统计学分析

应用统计软件SPSS(edition 17．0)进行统计学分析，数据以均值±标准差(±s)表示，计量资料用一元方差分析，数据间差别用P值表示，P＜0．05为差异有显著性。

2 结果

2．1 精子数目计数、精子活力检测结果

与对照组相比，模型组的精子计数、a级精子比率、a+b级精子比率均明显下降(P＜0．05)，说明造模成功;与模型组相比，ISA低、中、高剂量组精子数目明显上升(P＜0．05)，a级精子比率明显上升(P＜0．05)，a+b 级精子比率明显上升(P ＜0．05)，见表1。

表1 大鼠一侧附睾中精子计数及精子活力检测(±s)

表1 大鼠一侧附睾中精子计数及精子活力检测(±s)

注:模型组与对照组比较，#P＜0．05;药物治疗组与模型组比较，*P＜0．05

组别 例数 精子计数(106/ml) a级精子比率(%) a+b级精子比率(%)10 18．90 ±9．24 17．36 ±6．42 51．52 ±9．21模型组 9 7．21 ±2．46# 5．46 ±2．62# 21．51 ±7．31#ISA 低剂量 9 14．59 ±4．01* 12．05 ±5．72* 46．82 ±11．92*中剂量 10 15．49 ±6．35* 14．56 ±5．86* 49．71 ±10．52*高剂量 10 15．92 ±4．57* 17．22 ±7．52* 56．22 ±11．84对照组*

2．2 检测大鼠血清中睾酮(T)、促黄体激素浓度(LH)、促卵泡激素(FSH)浓度

与对照组相比，模型组血清中睾酮(T)略有降低，促黄体激素浓度(LH)的浓度略有变化，但并无显著性差异，促卵泡激素(FSH)浓度却有明显升高(P＜0．05)，而与模型组比较，ISA 低、中、高剂量组血清中睾酮(T)和促黄体激素浓度(LH)的浓度也无显著性差异;但而大鼠血清中促卵泡激素(FSH)浓度却有显著性降低(P＜0．05)，见表2。

表2 大鼠血清中睾酮(T)、促黄体激素浓度(LH)、促卵泡激素(FSH)浓度(±s)

表2 大鼠血清中睾酮(T)、促黄体激素浓度(LH)、促卵泡激素(FSH)浓度(±s)

注:模型组与对照组比较，#P＜0．05;药物治疗组与模型组比较，*P＜0．05

组别 例数 T(ng·ml－1) LH(mIU·ml－1) FSH(mIU·ml－1)10 3．02 ±2．11 4．33 ±1．59 2．70 ±1．12模型组 9 2．69 ±2．09 4．29 ±2．19 5．10 ±2．17#ISA 低剂量 9 2．60 ±2．19 5．19 ±2．12 3．29 ±1．59*中剂量 10 2．68 ±1．15 3．55 ±1．31 2．52 ±1．11*高剂量 10 2．89 ±1．01 3．64 ±1．68 1．79 ±1．03对照组*

2．3 HE染色观察生殖细胞层数结果:

与对照组相比，模型组的生殖细胞层数明显下降(P＜0．05)，说明造模成功;低、中、高剂量组与模型组比较，生精细胞层数显著增多(P＜0．05)，见表3。

2．4 各组睾丸、肝、脾、胸腺称重结果

各组比较，大鼠的睾丸、肝、脾、胸腺重量并无明显差异，见表4。

表3 大鼠睾丸HE染色后生殖细胞层数(±s)

表3 大鼠睾丸HE染色后生殖细胞层数(±s)

注:模型组与对照组比较，#P＜0．05;药物治疗组与模型组比较，*P＜0．05

10 5．44 ±1．01模型组 9 3．11 ±0．96#ISA 低剂量 9 4．83 ±1．21*中剂量 10 5．88 ±0．98*高剂量 10 4．76 ±0．99组别 例数 生殖细胞层数对照组*

表4 各组睾丸、肝、脾、胸腺重量(±s)

表4 各组睾丸、肝、脾、胸腺重量(±s)

注:模型组与对照组比较，#P＜0．05;药物治疗组与模型组比较，*P＜0．05

10 1．53 ±0．32 13．94 ±3．11 1．21 ±0．21 0．59 ±0．11模型组 9 1．31 ±0．31 12．01 ±1．83 1．05 ±0．09 0．57 ±0．09 ISA 低剂量 9 1．59 ±0．29 12．98 ±3．45 1．15 ±0．15 0．59 ±0．18中剂量 10 1．58 ±0．33 13．94 ±4．01 1．20 ±0．17 0．58 ±0．16高剂量/g对照组组别 例数 睾丸称重/g 肝称重/g 脾称重/g 胸腺称重10 1．55 ±0．31 14．98 ±1．78 1．24 ±0．28 0．61 ±0．79

3 讨论

本实验采用环磷酰胺造模，为常规少精弱精造模方法，临床观察其对男性生殖系统有损伤的副作用和对后代潜在致畸风险［9］，用环磷酰胺建立的模型能很好的模拟人类少弱精症状。表1显示，模型组精子数目显著下降证实造模成功，2，3-吲哚醌治疗后，精子计数升高，与生精小管生殖细胞恢复对应。精子活力方面，a+b级精子有受精能力，结果表明，2，3-吲哚醌治疗后，精子活动能力加强，证实了2，3-吲哚醌在提高精子密度及活性方面有一定疗效。

精子发生依赖于生精小管微环境的稳定，这需要性激素合理调节，及多种细胞的共同参与，其中FSH、LH、T是对精子发生起主要的调节作用的性激素。表2血清激素检测结果证实2，3-吲哚醌可以调节大鼠体内FSH水平，起到一定治疗作用。但结果也显示了ISA对大鼠血清中睾酮(T)和促黄体激素浓度(LH)并无显著影响，与部分文献报道不符［10］，可能实验过程中试剂盒不够灵敏，或实验标本量较少等原因造成。另外，在精子生成过程中，激素一般不是单独存在起作用的，由于各激素间互相影响，可能其他未检测激素或其他物质影响了实验结果。

精子生成主要在生精小管中完成，通过HE染色镜检睾丸切片可以观察到生精小管上皮层数和管腔精子数，便于了解造模剂、药物对生精小管的影响，了解细胞层面的变化，反映生精能力［11］。表3结果显示模型组中，造模剂发挥了作用，生殖细胞层数明显减少，表明精子发生微环境遭到破坏，生成精子的能力下降。2，3-吲哚醌治疗后，生殖细胞层数增加，管腔中精子增加，精子发生微环境得到一定恢复。

总之，通过对实验结果的观察分析，2，3-吲哚醌对环磷酰胺模拟的少弱精症有治疗作用，可以增加附睾精子数，提高精子活力，降低FSH水平，增加生精小管生殖细胞层数。2，3-吲哚醌作为天然新型促育生精药物，具有低毒副作用［12］，由表4结果中各组大鼠的睾丸、肝、脾、胸腺重要脏器的重量并无明显差异也可体现。关于2，3-吲哚醌的作用机制，作者猜测，ISA为单胺氧化酶抑制剂［2］，可能通过有效的延缓衰老，来提高精子质量、保护大鼠睾丸，也可能对血清NO和NOS的影响或是对生精细胞凋亡的影响，从而改善生殖障碍，确切机制还需进一步研究。因此，研究ISA的促育生精作用对于临床上研制新型海洋活性药物具有理论价值。

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