灰离褶伞菌中活性物质体外抗肿瘤实验研究

李春丰,姜 蓓,田 寅

(1.佳木斯大学生命科学学院,黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

食用菌是真菌中的可以食用或药用菇体种类的总称,具有肉质子实体。食用菌中含有生物活性物质对维护人体健康有重要的利用价值。以食用菌为原料生产加工的保健食品和药品用于医疗临床及投入保健品市场。因此,食用菌作为一种绿色食品受到各国人民的重视。食用菌不仅味美,而且营养丰富,常被人们称作健康食品,还具药用保健价值;降低血液中的胆固醇、治疗高血压的作用,还发现含有增强人体抗癌能力的物质。灰离褶伞。隶属于真菌门、同担子菌亚纲、伞菌目、白蘑科、离褶伞属,别名:块根蘑,俗称一窝鸡 ,我国一般多产于黑龙江、吉林、云南、西藏一带。灰离褶伞一般在夏末到秋季间生长,灰离褶伞喜好群生或者丛生,此种菌肉肥厚,味道鲜美,属优良食菌,可人工栽培。灰离褶伞是一种具有食药用价值的真菌,含有丰富的蛋白质、人体必需氨基酸、糖类、多种维生素营养素等有效成分,可治消化不良、胃肠胀满等。灰离褶伞具有较好的民间应用基础,临床治疗肿瘤也有较满意的疗效。具抗癌作用。为了探究灰离褶伞活性物质的抗肿瘤活性,本文在实验室自制灰离褶伞活性物质的基础上,进一步进行离子交换层析和凝胶过滤层析得到活性物质,并对两种活性物质进行了体外抑癌实验,为灰离褶伞的临床应用提供科学依据,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

灰离褶伞活性物质,由本实验室制备。细胞株供试瘤株为大肠癌 HT29、人胃癌细胞株 BGC823佳木斯大学动物实验中心惠赠。主要试剂甲醇、乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、香草醛显色剂、无水乙醇、环磷酰胺、浓硫酸等。硫酸显色剂、胰酶与 EDTA消化液、M TT等。主要仪器:高速低温离心机,薄层层析硅胶板,电子分析天平 、超低温冰箱、96孔培养板、倒置相差显微镜、超净工作台、CO2培养箱、酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 灰离褶伞活性物质提取方法

粉碎后的灰离褶伞子实体,用乙醇浸提浓缩。用乙酸乙酯和水溶解后,反复萃取,直至有机相无色,取有机相部分浓缩。将硅胶和石油醚混合 ,装入层析柱 ,石油醚为流动相,接样,直至柱内硅胶流实。有机相用硅胶拌样,用石油醚浸润,用滴管加到层析柱中。石油醚 /乙酸乙酯梯度洗脱,依次接样,每瓶约 250mL,然后蒸样浓缩 ,得70瓶。分别用薄层层析检板,合并相似的组分。对各个组分分别继续提纯。

1.2.2 处理液的配制

试验前用 RPMI-1640液溶解 ,分别配成 1.5 μg/mL、15 μg/mL、150 μg/mL的溶液 ,无菌过滤 ,备用。

1.2.3 细胞培养方法

将肿瘤细胞用贴壁细胞培养方法,HT29和 BGC823细胞用 RPMI-1640营养液培养,消化呈单个细胞,稀释、计数,每2天换液1次,加足营养液进行培养。按1:2比例传代,3～4d传代1次,收集对数生长期的细胞进行实验。

1.2.4 改良 M TT法

取对数生长期形态佳的两种瘤细胞。用0.25%胰酶和0.02%ETDA(1:1)消化液,消化分散成单个细胞,计数,稀释成 1～5× 104个 /mL,加入 96孔培养板每孔 200μL,置 5%CO2、37℃的培养箱中培养24h,然后加已稀释好的灰离褶伞提取物,阴性对照用相应培养液代之,阳性对照用环磷酰胺,20μL/孔 ,再 继 续培养 48h。取 HT29和 BGC823细胞 采 用M TT法,药物与细胞作用48h后,吸去培养液,加入 M TT显色,用酶标仪 (490nm波长)测出各孔光密度(OD)值。以光密度值(OD)表示细胞数量。抑制率%=(对照组 OD值-给药组 OD值)/对照组 OD值×100%。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 灰离褶伞活性物质对 HT29细胞生长的影响

从表1中可以看出,灰离褶伞活性物质对大肠癌 HT29细胞的抑制率均随着多糖浓度的增大而增大。说明灰离褶伞活性物质对 HT29细胞增殖的抑制作用有一定的剂量依赖性。灰离褶伞活性物质处理组的 M TT检测 OD值与阴性对照组间无显著差异外,其余各组的 M TT检测 OD值均显著或极显著低于阴性对照组。见表1。

表1 灰离褶伞活性物质对 HT29细胞生长的抑制作用

2.2 灰离褶伞活性物质对 BGC823细胞生长的影响

从表2中可以看出,灰离褶伞活性物质对人胃癌细胞株BGC823细胞的抑制率均随着多糖浓度的增大而增大。说明灰离褶伞活性物质 BGC823细胞增殖的抑制作用有一定的剂量依赖性。灰离褶伞活性物质处理组的 M TT检测 OD值与阴性对照组间无显著差异外,其余各组的 M TT检测 OD值均显著或极显著低于阴性对照组。见表2。

表2 灰离褶伞活性物质对 BGC823细胞生长的抑制作用

3 讨论

本试验用灰离褶伞活性物质对两种肿瘤细胞 HT29和BGC823进行体外试验 ,用 M TT法测定细胞的增殖抑制率,表明灰离褶伞活性物质对大肠癌 HT29、人胃癌细胞株BGC823两种肿瘤细胞均有较强的抑制作用,且其抑制率与浓度呈良好的量效关系。根据试验结果进行推测,其抗癌的机制可能是通过提高机体免疫功能而间接的影响癌细胞,抑制细胞的增殖,为进一步研究和开发白头翁抗肿瘤药物提供理论依据。

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