GDF-5诱导成纤维细胞分化为软骨样细胞

王艳秋 高阳 张曼 李德华

纤维软骨的结构特点为基质内含有90%以上的Ⅰ型胶原和少量Ⅱ型胶原，软骨细胞较小而少，这是与透明软骨的主要区别［1］。纤维软骨主要位于椎间盘的纤维环和膝关节的半月板等，结构和功能非常重要，其损伤破裂和退行性变都会引起严重的临床症状，组织工程学的修复和再生治疗为此提供了新思路。

人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts，hDFs)是结缔组织的主要细胞成分，能合成和分泌大量的Ⅰ型胶原和基质成分。致密的真皮层hDFs储备丰富，可以通过简单的活检手术取材，细胞增殖能力强，自体取材不涉及伦理学问题，是构建组织工程纤维软骨的首选种子细胞［2］。

研究表明生长分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF-5)是目前诱导成体间充质干细胞分化为软骨细胞的最有效生长因子［3］。因此，探讨应用GDF-5诱导hDFs分化为软骨样细胞意义重大。本实验拟应用GDF-5诱导hDFs向软骨样细胞分化，并从形态、基因和蛋白表达水平进行检测，探讨hDFs作为组织工程纤维软骨的种子细胞的可行性，为进一步构建组织工程纤维软骨提供种子细胞相关数据。

1 材料与方法

1.1 组织来源 人真皮组织来自5例行除皱术的健康成年女性患者，年龄30～45岁，无传染病和内分泌疾病，并签署知情同意书，实验经医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 L-DMEM、MTT、DMSO(Gibco);Ⅰ型胶原酶、L-脯氨酸、抗坏血酸、地塞米松、胰岛素、甲苯胺蓝(Sigma);GDF-5(PeproTeeh Inc);兔多抗Ⅰ、Ⅱ型胶原抗体、SABC试剂盒(博士德生物试剂公司)。

1.3 hDFs的分离与培养 取成人除皱术后的皮肤组织，消毒，PBS漂洗，剪成0.5～1 mm3的小块，Ⅰ型胶原酶室温消化3 h，200目筛网过滤并收集消化液，1000 r/min离心5 min，弃上清液。用L-DMEM液混悬，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。每3 d换液，达90%融合时传代培养。

1.4 hDFs的增殖活性检测 取P3、P6、P10的hDFs，胰酶消化，以1×104/ml的细胞悬液接种于96孔板，培养24 h后，于7 d内的每24 h取出一板，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，吸弃培养液，每孔加 DMSO 150 μl，震荡 10 min，用酶联免疫仪(Bio-Rad Model 680;美国)选择570nm波长测定各孔的光吸收值(OD值)。

1.5 检测Ⅰ型胶原的表达 取P3的细胞行细胞爬片，达90%融合时，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-100孵育，3%H2O2室温孵育，5%BSA封闭，兔多抗Ⅰ型胶原(1:200)，4℃孵育过夜，滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC试剂，DAB显色，苏木素复染，光镜观察。结果判定:细胞胞浆内可见不同程度的棕黄色颗粒为阳性表达。

1.6 诱导hDFs分化为软骨样细胞 取P3的hDFs，胰酶消化，以5×105/孔的细胞悬液接种于六孔板，细胞达90%融合时更换成软骨诱导培养液:含10%FBS的H-DMEM、100ng/ml GDF-5、10-7mol/L 地塞米松、37.5 mg/L 抗坏血酸、1 μmol/L胰岛素，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每3 d换液，相差显微镜观察。

1.7 检测Ⅱ型胶原的表达 取诱导28 d的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2室温孵育，5%BSA封闭后加入兔多抗Ⅱ型胶原(1:200)，4℃过夜。滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC试剂，DAB显色，苏木素复染，光镜下观察。结果判定:细胞胞浆内可见不同程度的棕黄色颗粒为阳性表达。

1.8 甲苯胺蓝染色检测GAG 取诱导28 d细胞爬片，PBS漂洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min。自来水冲洗15 min，蒸馏水洗5 min，加1%甲苯胺蓝2 h，95%乙醇去除多余染液。干燥后，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.9 统计学方法 所有数据均用均数±标准差表示，用SPSS 13.0软件，采用One-way ANOVA进行数据分析。P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 hDFs的形态学观察 原代培养的hDFs于接种24 h就有少量细胞贴壁，细胞呈梭形或纺锤形。3 d后细胞逐渐增多紧密排列。10 d左右细胞达到90%融合(图1)。传代细胞增殖明显，3～5 d即达90%融合。P10以后，增殖速度仍未减慢。

图1 原代培养10 d的hDFs(相差显微镜×100)

2.2 hDFs的生长曲线 MTT结果表明传代培养的hDFs在1～2 d为潜伏期，增殖较慢;2～4 d为对数生长期，细胞增殖加快并逐渐融合;于第4 d进入生长平台期并达峰值。P3，P6，P10的细胞生长曲线均呈“S”形(图2)。数据分析表明3种不同代数的hDFs在相同时间的OD值没有明显差异(P＞0.05)，说明传至第10代的hDFs仍能快速生长，增殖活性并未下降。

图2 传代hDFs的生长曲线

2.3 Ⅰ型胶原免疫细胞化学检测结果 P3的hDFs行免疫细胞化学染色，可见大部分细胞胞核染成蓝色，胞浆呈棕黄色阳性表达，表明原代培养的细胞能分泌Ⅰ型胶原，具备成纤维细胞的特性(图3)。

图3 hDFsⅠ型胶原免疫细胞化学染色(×100)

2.4 成软骨诱导后细胞的形态学观察 hDFs在GDF-5的诱导下细胞形态明显改变，10 d时细胞由长梭形逐渐变为多角形，21 d时细胞开始变圆或卵圆形并呈聚集样生长，形成类软骨样结节(图4)。

图4 诱导21 d的细胞(×100)

2.5 Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测结果 GDF-5诱导28 d的细胞行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，可见大部分细胞核蓝染，胞浆呈棕黄色阳性表达，表明GDF-5诱导后的细胞具备分泌Ⅱ型胶原的功能，符合软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的特性(图5)。

2.6 甲苯胺蓝染色检测GAG 经GDF-5诱导28 d细胞行甲苯胺蓝染色，可见大部分细胞被染成蓝色，说明诱导后的细胞可以分泌软骨细胞外基质的主要成分GAG，具备软骨样细胞的特性和功能(图6)。

图5 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色(×100)

图6 甲苯胺蓝染色(×100)

3 讨论

种子细胞是组织工程学的第一要素，自体软骨细胞来源及体外扩增受限，无法广泛应用于临床［4］。hDFs是结缔组织的主要细胞成分，通过有丝分裂大量增殖，并合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，参与人体创口的修复工作。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成Ⅰ型胶原纤维。hDFs可以通过简单的活检手术取材，并且致密的真皮层hDFs储备丰富，分离、培养方法简单而且细胞增殖能力强，可以自体取材不涉及伦理学问题，容易增殖［5］。因此，hDFs具有作为种子细胞的生物学特性。本实验应用Ⅰ型胶原酶消化法原代培养hDFs，细胞呈长梭形，涡轮状紧密排列。传代细胞生长形态均一，P10代以后的细胞仍具有很强的增殖能力。hDFs可以分泌Ⅰ型胶原蛋白，这在本实验中也得到了证实，经免疫细胞化学染色有棕黄色的阳性表达，说明本实验原代分离培养的细胞符合成纤维细胞的特性，属于hDFs。

探讨应用GDF-5将hDFs诱导分化为具有功能性的软骨样细胞是本研究的重点。GDF-5是TGF-β超家族中的一员，它可促进早期软骨和关节形成，是目前诱导成体间充质干细胞分化为软骨细胞的最有效生长因子［6］。因此本研究配制的软骨诱导液是含GDF-5的高糖DMEM等混合物。本实验GDF-5的浓度依报道［3］选用100ng/ml，其中诱导培养液中含有胰岛素可促进体外培养细胞存活、有丝分裂、糖原合成;丙酮酸钠是细胞培养中的替代碳源;BSA和脯氨酸作为细胞的营养成分，可促进细胞合成胶原;谷胺酰胺可补充必需氨基酸;维生素C是抗氧化剂，可抑制或减少细胞调亡［7］。

应用软骨诱导液培养后，hDFs由长梭形逐渐变为类圆形，并在某些区域聚集生长，形成软骨样结节，表明诱导后的细胞具备了软骨细胞的形态特征。同时对诱导后细胞进行软骨细胞相关指标的检测，Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性蛋白［8］，本研究发现诱导28 d后细胞经免疫细胞化学染色，显示细胞胞浆呈棕黄色阳性表达，核蓝染，说明经此诱导培养hDFs具备软骨细胞分泌特异性蛋白的生物学特性。GAG是软骨组织中含量最大的蛋白聚糖［9］，是软骨细胞分泌的细胞外基质成分。本实验对诱导28 d的细胞进行甲苯胺蓝染色，可见大部分细胞被染成蓝色，说明诱导后的细胞可以分泌GAG，具备软骨样细胞的特性和功能

综上所述，本实验从人真皮组织中成功分离培养hDFs，获取的细胞数量多、体外增殖迅速，可分泌合成Ⅰ型胶原。在GDF-5的诱导下可分化为软骨样细胞，具有软骨细胞形态，合成分泌了软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原蛋白和细胞外基质糖胺聚糖。因此，hDFs可以作为组织工程软骨的种子细胞。以后的研究可以应用hDFs的已软骨分化形式和未分化形式相结合的方法，共同作为组织工程纤维软骨的种子细胞，为成功构建组织工程纤维软骨找到理想的种子细胞。

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